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摘要

基因毒性雜質(zhì)的限度確定是藥物安全研究的重要內(nèi)容。有潛在基因毒性的雜質(zhì)根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征和毒理學(xué)數(shù)據(jù)可分為5 類: 已知有致突變性及致癌性的雜質(zhì)、有致突變性但致癌性未知的雜質(zhì)、含有與藥物活性成分結(jié)構(gòu)無關(guān)的警示結(jié)構(gòu)但無致突變性數(shù)據(jù)的雜質(zhì)、含與藥物活性成分相關(guān)警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)以及致癌風(fēng)險高的特殊雜質(zhì)。本文以毒理學(xué)評價的方法，分類對基因毒性雜質(zhì)的評估策略進(jìn)行綜述，并示例雜質(zhì)限度確定的方法。

關(guān)鍵詞

基因毒性雜質(zhì); 安全性評價; 毒理學(xué)

基因毒性雜質(zhì)是藥物在合成、儲存或者制劑過程中形成的能與細(xì)胞或生物體的DNA 反應(yīng)，對DNA 有潛在破壞性的雜質(zhì)，也包括一些結(jié)構(gòu)上類似基因毒性物質(zhì)但未經(jīng)實驗證明具有基因毒性的雜質(zhì)。

基因毒性物質(zhì)的特點是在任何暴露量下都有可能對DNA 產(chǎn)生損傷，進(jìn)而可能誘發(fā)腫瘤。因其毒性較強(qiáng)、潛在風(fēng)險大，對用藥的安全性有強(qiáng)烈的威脅。近年來在已上市藥品中因為痕量的基因毒性雜質(zhì)殘留而引發(fā)的醫(yī)療事故和禁售事件也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如最早引發(fā)關(guān)注的甲磺酸奈非那韋事件和近兩年出現(xiàn)的N-亞硝基二甲胺事件，因此人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議( ICH) 、歐洲EMEA 及美國FDA 等機(jī)構(gòu)都陸續(xù)提出了基因毒性雜質(zhì)研究策略和限度要求［1］，我國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心( CDE)也于2020 年5 月8 日發(fā)布了《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則( 試行) 》［2］，為“關(guān)注雜質(zhì)”的研究和控制提供指導(dǎo)，國內(nèi)外醫(yī)藥機(jī)構(gòu)在新藥研發(fā)過程中也越來越關(guān)注基因毒性雜質(zhì)的控制和檢測。

雜質(zhì)在化合物合成過程中是難以避免的，且種類多、分類困難，為了區(qū)分普通雜質(zhì)和基因毒性雜質(zhì)，各法規(guī)和指導(dǎo)原則普遍采用了“警示結(jié)構(gòu)”的方法，將可能引起基因毒性的結(jié)構(gòu)列入關(guān)注隊列，含有這些基團(tuán)的雜質(zhì)通常被認(rèn)為具有潛在基因毒性。化合物是否含基因毒性雜質(zhì)可以通過化學(xué)反應(yīng)機(jī)制來分析確認(rèn)，實際產(chǎn)生的有明確遺傳毒性閾值的雜質(zhì)，可以通過制定限度標(biāo)準(zhǔn)將暴露水平限定在安全范圍內(nèi); 對于有潛在基因毒性的雜質(zhì)，可通過查詢“警示結(jié)構(gòu)”數(shù)據(jù)庫來確認(rèn)，這類雜質(zhì)由于沒有充分的證據(jù)或?qū)嶒瀬碇С制溟撝迪嚓P(guān)機(jī)制，所以無法確定安全劑量，需要進(jìn)行藥學(xué)和毒理學(xué)評估。

藥學(xué)評估主要是選擇適當(dāng)?shù)呐浞胶蜕a(chǎn)策略，以避免或減少基因毒性雜質(zhì)的產(chǎn)生，在遵循“合理可行的最低限量”( as low as reasonably practicable，ALAＲP) 原則的基礎(chǔ)上，再經(jīng)過毒理學(xué)評估以驗證其合理性。

基因毒性雜質(zhì)的毒理學(xué)評估遵循“具體問題具體分析”原則［3］，本文根據(jù)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征和毒理學(xué)數(shù)據(jù)，將雜質(zhì)分為5 類分別對毒理學(xué)評估策略進(jìn)行綜述，并示例雜質(zhì)限度確定的方法。

1、基因毒性雜質(zhì)的毒理學(xué)評估策略

1、1已知有致突變致癌性的雜質(zhì)，包括具有足夠遺傳毒性作用機(jī)制數(shù)據(jù)的動物致癌物和人類致癌物這類物質(zhì)可基于文獻(xiàn)報道和數(shù)據(jù)庫來確認(rèn)，其致突變和致癌性實驗結(jié)果為陽性，但是只有在超過一定限度才產(chǎn)生毒性效應(yīng)。對于有足夠致癌性數(shù)據(jù)的物質(zhì)，可以直接采用已公布的測定數(shù)據(jù)制定限度標(biāo)準(zhǔn)，或根據(jù)動物致癌性強(qiáng)度數(shù)據(jù)，采用線性外推法計算人體可接受攝入量; 對于有明確遺傳毒性閾值的物質(zhì)，可以參照ICH Q3C 的方法，根據(jù)相關(guān)動物實驗的“未觀察到效應(yīng)水平”( no-observed effect level，NOEL) 或“觀察到有害效應(yīng)的最低水平”( lowest-observedadverse effect level，LOAEL) ，計算“每日允許暴露量”( permissible daily exposure，PDE) 。致突變致癌物數(shù)據(jù)主要來源于毒理學(xué)研究結(jié)果，因此對于權(quán)威數(shù)據(jù)庫中已列出的基因毒性雜質(zhì)，可根據(jù)已知數(shù)據(jù)將雜質(zhì)限定在安全限度之下，無需再進(jìn)行毒理學(xué)實驗。此類雜質(zhì)在藥物研發(fā)和生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量避免產(chǎn)生，如果無法避免，應(yīng)該優(yōu)化相關(guān)工藝以減少其含量，并制定合理的分析檢測方法進(jìn)行限度控制。

1、2 已知具有致突變性但致癌性未知的雜質(zhì)這類物質(zhì)通常在體外遺傳毒性實驗中為陽性結(jié)果，如細(xì)菌回復(fù)突變實驗、染色體畸變實驗，但是嚙齒類動物的致癌性數(shù)據(jù)未見報告。在缺乏體內(nèi)關(guān)聯(lián)信息時，通常體外基因毒性物質(zhì)也被假定為體內(nèi)誘變劑和致癌劑，但由于缺乏產(chǎn)生生物學(xué)意義的閾值數(shù)據(jù)，安全暴露水平無法確定，因此在歐洲EMA 發(fā)布的《基因毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》中引入了“毒理學(xué)關(guān)注閾值”( threshold of toxicological concern，TTC) 的概念，為無法確定暴露水平的基因毒性雜質(zhì)提供一個可接受的攝入水平，通常認(rèn)為攝入量在低于此水平時患癌的風(fēng)險將遠(yuǎn)低于正常風(fēng)險水平，經(jīng)過對多個致癌性物質(zhì)的致癌能力概率分布進(jìn)行分析驗證，得到適用于大多數(shù)致癌物質(zhì)的TTC 估值為每人1． 5μg·d －1。因此對于無法確定閾值的基因毒性雜質(zhì)，通常認(rèn)為人每日攝入量低于1． 5 μg 時，誘發(fā)癌變的風(fēng)險是可以接受的。一些特殊的不宜采用TTC 評估的雜質(zhì)，如果在體外遺傳毒性實驗中呈陽性結(jié)果，也可以采用一些反應(yīng)機(jī)制相似或具有預(yù)期靶組織暴露的體內(nèi)試驗( 如微核試驗、體內(nèi)基因突變試驗、彗星試驗等［3］) 進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究，為設(shè)定限度指標(biāo)提供數(shù)據(jù)支持。

對于一些例外情況，如短期用藥，用來治療威脅生命疾病的藥物，用藥者的存活期預(yù)期較短，或該雜質(zhì)由其他途徑獲得的暴露量遠(yuǎn)高于藥物時，需要進(jìn)行風(fēng)險效益評估，必要時TTC 值可以高于1． 5 μg·d－1。

1、3含有與藥物活性成分結(jié)構(gòu)無關(guān)的警示結(jié)構(gòu)但無致突變性數(shù)據(jù)的雜質(zhì)警示結(jié)構(gòu)的重要性在于提示可能存在的基因毒性和致癌性，為進(jìn)一步安全性評價和制定控制策略指明方向，但具有警示結(jié)構(gòu)并不一定具有基因毒性，因此對這一類雜質(zhì)，需要通過毒理學(xué)方法來評價，通常采用細(xì)菌回復(fù)突變實驗檢測分離的雜質(zhì)或雜質(zhì)與藥物活性成分的混合物，如果實驗結(jié)果為陰性，可按照一般雜質(zhì)控制，如果細(xì)菌回復(fù)突變實驗顯示警示結(jié)構(gòu)具有基因毒性，可采用TTC 來確定限度，必要時根據(jù)體外實驗的陽性結(jié)果追加合適的體內(nèi)試驗進(jìn)一步驗證。例如，對于細(xì)菌回復(fù)突變實驗在非S9 代謝活化條件下出現(xiàn)的陽性結(jié)果，可采用Pig-a 基因突變實驗來檢測直接作用的致突變物，或采用微核試驗檢測直接誘變劑和染色體斷裂劑; 如果細(xì)菌回復(fù)突變實驗的陽性結(jié)果僅出現(xiàn)在S9 代謝活化條件下，且推測該雜質(zhì)可在肝臟誘導(dǎo)大的加合物，可采用大鼠肝臟程序外DNA 合成實驗; 如果已有信息表明雜質(zhì)具有導(dǎo)致DNA 前期損傷的化學(xué)結(jié)構(gòu)特異性作用，如形成堿基不穩(wěn)定位點或單鏈斷裂，可選擇彗星試驗。

1、4警示結(jié)構(gòu)與藥物活性成分相關(guān)的雜質(zhì)所含警示結(jié)構(gòu)與藥物活性成分的結(jié)構(gòu)相同，或與藥物中結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物的警示結(jié)構(gòu)相同，此類雜質(zhì)如果已有數(shù)據(jù)或?qū)嶒炞C明該警示結(jié)構(gòu)無致突變性，則按一般雜質(zhì)控制，不需要對雜質(zhì)進(jìn)行毒理學(xué)實驗。

1、5 致癌風(fēng)險高的特殊雜質(zhì)另外有一些特殊物質(zhì)，在長期毒性研究中有確切致癌性證據(jù)，或在國際認(rèn)可的數(shù)據(jù)庫中被列為高風(fēng)險致癌物，如黃曲霉素類、N-亞硝基物和偶氮類化合物，它們的攝入量在低于1． 5 μg·d －1 時仍有非常高的致癌風(fēng)險［4］，因此使用通常的TTC 值來評估并不合適，需要建立特定的風(fēng)險評估方法，具體問題具體分析。CDE 發(fā)布的《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則( 試行) 》正是基于這類雜質(zhì)的特殊性提出的，對于此類雜質(zhì)，應(yīng)采取“避免為主，控制為輔”的策略，在毒理學(xué)評估中，可以參考以下思路［2］。

對于在權(quán)威機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中有足夠致癌數(shù)據(jù)的雜質(zhì)，可以根據(jù)其50%腫瘤發(fā)生率( TD50) 的劑量外推計算十萬分之一腫瘤發(fā)生率的劑量，以此作為該雜質(zhì)的可接受攝入量，再結(jié)合藥品的每日最大用藥量，可以得到雜質(zhì)的控制限度。在選擇TD50時，應(yīng)選擇已有數(shù)據(jù)中最保守的值，即“來自研究設(shè)計完善的致癌性試驗中的最低TD50值，或與人類風(fēng)險評估最相關(guān)的種屬、性別和腫瘤發(fā)生器官部位的最低TD50值”。如果數(shù)據(jù)庫中沒有該致癌性雜質(zhì)的TD50值，可通過構(gòu)-效關(guān)系分析來選擇效應(yīng)相似且有TD50的同類雜質(zhì)，導(dǎo)用其TD50值來計算雜質(zhì)限度。

2、根據(jù)毒理學(xué)數(shù)據(jù)確定雜質(zhì)限度的示例 

2、1根據(jù)TD50線性外推法計算N-亞硝基二甲胺( nitrosodimethylaniline，NDMA) 的可接受攝入量NDMA 被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)( InternationalAgency for Ｒesearch on Cancer， IAＲC) 列為2A類致癌物，在遺傳毒性與致癌性實驗中均為陽性結(jié)果，對動物致癌證據(jù)充分，對人的致癌風(fēng)險較高，因此不適合按每人1． 5 μg·d－1的TTC 值來制定限度，需要根據(jù)NDMA 的致癌性數(shù)據(jù)進(jìn)行特定風(fēng)險評估。致癌性數(shù)據(jù)庫( Carcinogenicity Potency Database，CPDB) ［5］提供的數(shù)據(jù)顯示，在研究完善的致癌性實驗中，NDMA 在大鼠與小鼠的TD50值分別為0． 095 9和0． 189 mg·kg－1d －1，其中大鼠的TD50值更保守。人體重以50 kg 計算，腫瘤發(fā)生風(fēng)險設(shè)為0. 1，則按大鼠TD50線性推導(dǎo)出人對NDMA 的可接受攝入量為: 0． 095 9 mg·kg －1·d －1 × 50 kg ÷ 50% × 10 － 5 =0． 000 095 9 mg·d－1。

以2018 年7 月檢出含NDMA 雜質(zhì)的纈沙坦原料藥為例，纈沙坦每日最大用藥以320 mg 計算，則其中NDMA 雜質(zhì)的限度設(shè)定為: 0． 000 095 9 mg·d －1÷320mg·d －1 = 0． 000 03%。

2、2 根據(jù)“未觀察到效應(yīng)水平”計算苯胺的“每日允許暴露量” 苯胺為一種已知的動物致癌物，可誘導(dǎo)大鼠脾臟腫瘤生成，且研究顯示其致癌性存在閾值，因此不適用TD50線性推導(dǎo)的方法，可采用相關(guān)動物實驗的未觀察到效應(yīng)水平來計算每日允許暴露量。根據(jù)來自化學(xué)工業(yè)毒理學(xué)研究所( ChemicalIndustry Institute of Toxicology，CIIT) 一項2 年的大鼠致癌性研究數(shù)據(jù)，喂飼相當(dāng)于7． 2， 22 和72 mg·kg－1·d －1苯胺劑量水平的鹽酸苯胺，在72 mg·kg－1·d－1 劑量雄性中觀察到腫瘤，并在22 mg·kg－1·d －1 劑量組發(fā)現(xiàn)一個脾臟間質(zhì)肉瘤，基于以上數(shù)據(jù)，7． 2 mg·kg －1·d －1的劑量被用來作為腫瘤的NOEL，按ICHQ3C 中的方法使用不確定因子來計算苯胺的每日允許暴露量，PDE = ( NOEL × 體重校準(zhǔn)) ÷ ( F1 × F2 ×F3 × F4 × F5) ，其中: 體重校準(zhǔn)= 50 kg; F1 = 5( 從大鼠到人) 種屬間差異系數(shù); F2 = 10 ( 個體間差異系數(shù)) ; F3 = 1 ( 研究持續(xù)時間至少為動物壽命的一半) ; F4 =10( 嚴(yán)重毒性－ 非遺傳毒性致癌性) ; F5 = 1( 使用NOEL) ，由此可計算苯胺在人體的終生PDE =7． 2 mg·kg －1·d－1×50 kg ÷ ( 5 ×10 ×1 × 10 × 1) = 0． 72mg·d －1。

3、小 結(jié) 

對于基因毒性雜質(zhì)或潛在基因毒性雜質(zhì)，無論其是否有閾值相關(guān)機(jī)制的證據(jù)，研究和控制的依據(jù)都是毒理學(xué)數(shù)據(jù)，尤其是遺傳毒性和致癌性實驗結(jié)果，其中最基礎(chǔ)的是細(xì)菌致突變實驗，通常用來評估雜質(zhì)致突變的可能性及控制的必要性。但是常規(guī)遺傳毒性實驗方法存在局限性，如無法檢出非遺傳毒性致癌劑，體外實驗與體內(nèi)的相關(guān)性需要驗證，且不適用于確定“可接受的攝入水平”。因此在開展毒理學(xué)評估前，首先應(yīng)該查詢“警示結(jié)構(gòu)”數(shù)據(jù)庫和已知致癌物數(shù)據(jù)庫，并根據(jù)文獻(xiàn)或計算機(jī)毒理學(xué)分析雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，判斷開展毒理學(xué)實驗的必要性，并預(yù)測其可能的遺傳損傷終點或作用機(jī)制，選擇檢測終點一致或能提供機(jī)制信息的實驗方法。另外由于檢測靈敏度限制，使用含雜質(zhì)的原料藥進(jìn)行研究，可能會由于雜質(zhì)含量太低而出現(xiàn)陰性結(jié)果，這時使用分離出的雜質(zhì)進(jìn)行研究更合理。在根據(jù)毒理學(xué)數(shù)據(jù)確定雜質(zhì)限度時，可參考的文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)較多，使用不同的數(shù)據(jù)得出的限度會有差異［6］，只要有充分合理的依據(jù)，通常都是可以接受的?；蚨拘噪s質(zhì)的來源和構(gòu)成復(fù)雜，其安全性評價需要綜合運用多種手段，毒理學(xué)評估作為其中一個環(huán)節(jié)，也要結(jié)合化學(xué)及藥學(xué)相關(guān)知識、相關(guān)工藝和檢測技術(shù)，充分利用新方法和毒理學(xué)數(shù)據(jù)，制定合理的評估策略，同時在必要時開展機(jī)制研究，或采用體內(nèi)相關(guān)性研究來幫助確定雜質(zhì)的限度，將基因毒性雜質(zhì)對人體的潛在威脅控制在安全范圍內(nèi)。