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1.問題描述

1.1 含量測定中，對照品主峰與樣品主峰RT值無法完全重合；

1.2 檢測限1.3%，靈敏度達(dá)不到要求（要求定量限≤0.2%）

2.原分析方法參數(shù)與圖譜

2.1 原方法參數(shù)

2.2 典型圖譜

3.原因分析

3.1 波長過低，在線混合，導(dǎo)致基線噪音大，含量1.30%才能達(dá)到LOD水平；

3.2 進(jìn)樣量4μL，HPLC中，一般雜質(zhì)外標(biāo)的含量不低于5μL；

3.3 樣品溶液呈酸性（原配樣方式直接用乙腈稀釋），磷酸緩沖鹽pH4.5左右，無緩沖能力；

3.4 在線混合，HILIC色譜柱平衡時間很長，若無梯度要求，應(yīng)預(yù)混好流動相。

4.方法優(yōu)化

4.1 優(yōu)化樣品前處理方式

樣品配制方法：樣品溶液稱取規(guī)定量于容量瓶中，先用三乙胺調(diào)節(jié)pH至6-7，再用乙腈稀釋至容量瓶刻度線。

原方法參數(shù)進(jìn)此溶液得到和上述一樣的圖譜，對照品主峰還是不能與樣品主峰完全重合。

4.2 優(yōu)化方法參數(shù)

4.3 優(yōu)化圖譜

4.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）提高波長至205nm；預(yù)混流動相；提高進(jìn)樣量至5μL；這三種方式，提高了方法的靈敏度。經(jīng)預(yù)驗(yàn)證后，LOQ限度為0.083%，大大提高了方法的靈敏度。

（2）使用5mM磷酸二氫鉀+5mM磷酸氫二鉀的緩沖液，提高了方法的緩沖能力，樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液RT值能完全重現(xiàn)。

5.總結(jié)

5.1 靈敏度計(jì)算公式S/N=2H/noise,所以靈敏度不完全取決于峰高，要綜合比對峰高和噪音，選取合適的波長；

5.2 樣品過酸或者過堿，可能會導(dǎo)致RT重現(xiàn)性較差，可通過提升緩沖液的緩沖能力去解決（緩沖液pH與樣品溶液的pka需相差1.5以上）。

以下是部分緩沖液的緩沖范圍

5.3 若是無梯度變化，可預(yù)混流動相，規(guī)避在線混合產(chǎn)生氣泡導(dǎo)致RT漂移的情況發(fā)生；