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什么是液相色譜？

液相色譜（liquid chromatography，LC）是一種色譜技術(shù)，用于分離和分析溶液中混合物的化學成分，以確定是否存在或不存在特定成分，如果存在，則存在多少。我們中的許多人會從上學開始就熟悉平面LC的形式，在濾紙上打上黑色墨水標記，將一端浸入水中，然后觀察墨水中的成分顏色是否分開。但是，分析應(yīng)用中使用的大多數(shù)LC均基于柱色譜法，這將是本文的重點。顧名思義，高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是使用高色譜分辨率進行高效分離的高性能分析。分離的組分也可以在檢測后使用餾分收集器分離，作為純化的手段。HPLC有多種不同的配置，可用于分離分子量從半揮發(fā)性小分子到幾萬千道爾頓的大蛋白生物分子的溶解組分。液相色譜法是一種非常流行的分析技術(shù)，廣泛用于環(huán)境監(jiān)控，農(nóng)業(yè)，醫(yī)藥領(lǐng)域。

 

液相色譜如何工作？

液相色譜儀有多種不同的系統(tǒng)配置，其中最高效率的分離是在超高效液相色譜（UHPLC）儀器上進行的，該技術(shù)于2004年首次商業(yè)化，被稱為超高效液相色譜（UPLC）。簡而言之，由于各個組分在流動相（下圖1（1））和固定相（柱）（圖1（3））之間的獨特分配，可溶于液相流動相的多組分混合物得以分離。

圖1：連接質(zhì)譜儀（LC-MS）的液相色譜儀簡化圖。（1）用于流動相的二元泵，（2）自動進樣器的6通閥和進樣器環(huán)路，（3）色譜柱加熱器（4）質(zhì)譜儀檢測器，（5）PC。

 

流動相通常是溶劑，借助高壓泵（圖1（1））將樣品輸送并且通過系統(tǒng)。它在分離過程中也起著至關(guān)重要的作用。

 

將少量樣品（1-100 µL）裝入樣品定量環(huán)（圖1（2）），然后通過六通閥注入流動相中，這會觸發(fā)色譜的啟動。進樣后，將流動相泵入色譜柱（圖1（3））。有多種色譜柱長度（30到250毫米）和內(nèi)徑（1到4.6毫米）可供選擇，填充有不同活性和粒徑（1.5到10微米直徑）的固定相吸附材料，共同決定了色譜柱的效率和選擇性。該柱位于柱箱中。在較高溫度（45ºC）下，流動相的粘度降低，從而增加了其線速度。反過來，減少了運行時間，也提高了色譜分離度。

 

混合物中對流動相具有較高親和力的組分將快速遷移通過色譜柱，而與固定相之間幾乎沒有相互作用。當組分的帶離開色譜柱或從色譜柱洗脫時，檢測器（圖1（4））將給出與組分濃度成正比的響應(yīng)。進樣與檢測之間的時間稱為保留時間。對于一組給定的色譜條件，組分的保留時間將非常明確，可以與鑒定標準進行比較。

 

在反相色譜法中，極性較小的分析物會優(yōu)先分配到非極性固定相中，并且保留時間更長。數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（圖1（5））將檢測器響應(yīng)記錄為色譜圖中保留時間的函數(shù)。通常對色譜圖中記錄的峰（下圖2）進行積分以確定峰面積，該峰面積與樣品中存在的組分的濃度成正比。

 

 

圖2：HPLC或LC-MS的色譜圖輸出。

 

自動進樣器將樣品注入流動相后，在色譜柱中進行分離過程。色譜系統(tǒng)的選擇性對色譜分辨率的影響最大，應(yīng)針對所研究的應(yīng)用和組件進行定制。選擇性可以通過改變流動相（不同溶劑）或固定相中存在的特定化學官能團（改變色譜柱類型）的電化學強度來改變。

 

考慮到流動相，運行液相色譜儀時有兩種主要的操作模式可供選擇，即等度或梯度。等度方法將在色譜運行期間使用相同的流動相組成，而選擇性沒有變化。梯度方法將使流動相的組成隨時間變化，通常可以對其進行優(yōu)化以提高色譜分辨率或縮短運行時間。

 

固定在色譜柱內(nèi)的固定相的化學性質(zhì)會影響該技術(shù)的選擇性。反相HPLC或UHPLC是最流行的系統(tǒng)配置，并使用非極性固定相（例如十八烷基硅烷（ODS或C18））和極性流動相（水/甲醇）。其他反相固定相包括八硅烷（C8），它的疏水性比C18小，對極性較小的分析物的保留時間也相應(yīng)較短。如果使用被酚取代基官能化的色譜柱，由于其親和力的提高，這將增加酚組分的保留。

 

流動相的pH對離子組分的保留時間有深遠的影響，在方法開發(fā)過程中應(yīng)加以利用。緩沖液可用于將流動相的pH維持在離子組分的pK a以下兩個單位，這反過來將其解離平衡轉(zhuǎn)變?yōu)橹行孕问?。組件的中性形式極性較小，因此可以控制其保留時間。

 

正相色譜法是另一種液相色譜方法，可根據(jù)其極性分離分析物，實際上是在引入反相液相色譜法之前開發(fā)的，但不太普及。固定相在正相色譜法中為極性流動相是非極性的。這改變了系統(tǒng)的保留特性，混合物的非極性組分首先以最短的保留時間被洗脫。極性分析物對固定相的親和力更高，隨后洗脫時間更長，保留時間更長。還有其他類型的液相色譜，包括離子色譜，離子對，尺寸排阻，親和力，列表不勝枚舉。除了尺寸排阻色譜法可以根據(jù)其大小/形狀或分子量分離分析物外，上述提及的其他形式的液相色譜儀均采用不同的流動相和固定相化學方法。對于給定的一組要分離的組分，可獲得的選擇性和色譜分離度由所用的固定相和流動相定義。

 

組件一旦分離，就需要進行檢測。探測器的選擇由應(yīng)用程序的方法目標驅(qū)動；各種選項都具有不同程度的靈敏度，特異性，選擇性和線性動態(tài)范圍。最受歡迎的檢測器是紫外線可見（UV-Vis）檢測器，該檢測器可測量特定波長下光的吸收率。根據(jù)要分析的組分的λ最大值選擇波長，檢測器的響應(yīng)與該特定組分的濃度成正比。隨著組分從色譜柱上洗脫下來，其在檢測器流通池中的濃度會上升和下降，然后將其繪制為色譜峰（參見圖2）。數(shù)據(jù)采集速率應(yīng)設(shè)置為在整個峰中至少采集20個數(shù)據(jù)點。與許多色譜技術(shù)一樣， 

 

用于互連LC系統(tǒng)各個組件的管道的長度和內(nèi)徑至關(guān)重要，應(yīng)保持絕對最小。從注入回路開始到檢測器流通池末端的色譜系統(tǒng)的任何部分（不是固定相）都無助于有效分離。系統(tǒng)內(nèi)的這種額外體積稱為空隙體積，空隙中分離成分的額外縱向擴散將導致靈敏度損失和色譜分離度降低。

 

HPLC到UHPLC從的演變

UHPLC的發(fā)展部分是由于分析人員對日益復雜和具有挑戰(zhàn)性的樣品進行更高分辨率分離的要求不斷提高。使色譜性能發(fā)生這一階段變化的主要突破是開發(fā)了具有窄粒度分布的亞2微米固定相填料。

 

生產(chǎn)的新顆粒具有與常用HPLC固定相相同的化學功能，可確保在使用相同的流動相時保持色譜系統(tǒng)的選擇性。當使用新的亞2微米包裝材料時，效率的提高或板數(shù)的增加實現(xiàn)了顯著的性能優(yōu)勢。

 

將HPLC方法遷移到UHPLC系統(tǒng)時，有許多優(yōu)點，包括運行時間更短，色譜分離度更高，靈敏度更高以及溶劑消耗更少。為了使用新型UHPLC色譜柱，必須使用可以在較高壓力下運行的泵，以適應(yīng)色譜柱中較小顆粒施加的增加的背壓。檢測器流通池還需要升級以具有較小的內(nèi)部體積，這對于檢測從色譜柱上洗脫下來的組分的較窄譜帶是必需的。還需要相應(yīng)地提高數(shù)據(jù)采集速率，以確保峰值之間有足夠的數(shù)據(jù)點。

 

液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）

質(zhì)譜分析可以說是最好的可與液相色譜儀聯(lián)用的檢測器，因為它在使用具有很高質(zhì)量分辨能力的儀器時具有很高的靈敏度，線性動態(tài)范圍，選擇性甚至特異性。質(zhì)譜技術(shù)用于確定組分或分析物的質(zhì)荷比（m/z）。與氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）不同，液相色譜系統(tǒng)向質(zhì)譜聯(lián)用的過程并不容易，并且需要花費很多年的開發(fā)時間。電噴霧電離（ESI）是當今LC-MS中最常用的電離技術(shù)，其中電離過程在大氣壓下進行。很難達到質(zhì)譜系統(tǒng)所需的高真空的大氣壓入口。

 

如何讀懂LC-MS質(zhì)譜圖，它告訴您什么？

電噴霧電離是一種非常柔軟的電離技術(shù)，這意味著在離子形成過程中觀察到的碎片很少。對于生成質(zhì)子化分子[M+H] +的堿性分析物，可以在正離子模式下運行，對于生成去質(zhì)子化分子[MH] -的酸性分析物，可以在負離子模式下運行LC-MS系統(tǒng)。

 

是可能的碎片離子通過電噴射過程通常是通過碰撞誘導解離（CID），以獲得用于表征或靶分析物的識別信息生成的。CID可以在離子源中通過更改施加到第一采樣錐或撇渣錐的電勢差來執(zhí)行，也可以在碰撞池中將離子加速到諸如氬氣的碰撞氣體中執(zhí)行。

 

下圖3表示全掃描LC-MS采集，其中源內(nèi)碰撞引起解離，從而為混合物的每個分離組分產(chǎn)生一系列特征性碎片離子。質(zhì)荷比（m/z）沿x軸繪制，離子的強度或相對豐度沿y軸繪制。圖3上的z軸代表分離的組分的保留時間，每個基線解析色譜峰一次用質(zhì)譜儀分析一次，關(guān)鍵的診斷碎片離子可用于鑒定和目標離子確認。

 

圖3： 全掃描LC-MS質(zhì)譜圖，MS添加了額外的信息維度。

 

將液相色譜法納入多個維度

當處理復雜的多組分混合物時，可能無法基線解析每個組分，因為各個峰會從色譜柱上洗脫下來。如果由于缺乏選擇性而無法提供色譜分離度，那么方法開發(fā)和優(yōu)化只能幫助您解決問題，那么可能有必要使用其他具有選擇性的色譜柱來分離共洗脫組分。

 

多維色譜可使共洗脫組分通過“心切”法以更合適的選擇性轉(zhuǎn)移到另一個色譜柱上，從而可以將分離拆分為單個洗脫組分。該系統(tǒng)可以設(shè)置有轉(zhuǎn)移閥，該轉(zhuǎn)移閥將檢測后的第一維或色譜柱中的共洗脫峰簡單地轉(zhuǎn)移到第二維中，以進行后續(xù)分離和更高的色譜分離度檢測。

 

半制備液相色譜法純化

通過擴大液相色譜系統(tǒng)的尺寸，使用具有較大內(nèi)徑且以較高流速運行的色譜柱，可以將更多的材料裝載到色譜柱上。半制備色譜系統(tǒng)可能裝有100毫克的樣品。然后使用餾分收集器將色譜峰從色譜柱上洗脫下來，收集到單獨的樣品瓶中。餾分收集器由檢測器觸發(fā)，檢測器在色譜基線中尋找表明峰開始的拐點，然后將分離出的組分的峰收集為純餾分。然后可以對分離出的餾分進行補充質(zhì)譜的其他分析技術(shù)，例如核磁共振（NMR），以充分表征化合物的結(jié)構(gòu)說明。

 

液相色譜法的優(yōu)缺點

LC通常用于各種應(yīng)用。但是，它不適用于揮發(fā)性化合物的分離和分析。僅當所有要分離的組分的蒸氣壓低于流動相的蒸氣壓時，才能實現(xiàn)可靠的分析型液相色譜方法。氣相色譜法更適合分析揮發(fā)性化合物。

 

提供各種不同的色譜柱和溶劑，可提供廣泛的選擇性，從而可以分離極性范圍很廣的組分。大分子和小分子同樣適用于該技術(shù)。在相對較低的溫度下進行有效分離的能力也使LC成為可在氣相色譜儀中分解的熱不穩(wěn)定化合物的理想分離技術(shù)。

 

液相色譜法的常見問題

樣品準備是成功的關(guān)鍵；在將所有樣品加載到自動進樣器中之前，必須對所有樣品進行過濾，這一點非常重要。當使用UHPLC時，如果不過濾樣品，使用亞2微米顆粒的色譜柱進行高效分離時很容易發(fā)生阻塞，這一點就尤為重要。對于流動相也是如此，尤其是在使用緩沖區(qū)的情況下。

 

對于樣品使用正確的進樣溶劑或稀釋劑至關(guān)重要，溶劑強度應(yīng)等于或小于流動相起始條件的強度。如果使用太強的溶劑，則會觀察到峰分裂和重現(xiàn)性差。如果自動進樣器中使用的清洗溶劑太強，可能會觀察到類似的問題。

 

所獲取色譜圖的基線波動或保留時間的重現(xiàn)性差，很可能是由于泵（圖1（1））或真空脫氣機出現(xiàn)問題而導致的。如果泵或真空脫氣機維護不當，止回閥可能會部分卡住，從而引起壓力波動。這些問題可以通過確保按照制造商指南執(zhí)行預防性維護任務(wù)來解決，以防止計劃外的停機時間和較差的性能。

 

參考文章：

1. García‐Alvarez‐Coque MC, Baeza‐Baeza JJ, Ramis‐Ramos G. Reversed Phase Liquid Chromatography. In: Analytical Separation Science. American Cancer Society; 2015:159-198. doi:10.1002/9783527678129.assep008

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3. Cooper WT. Normal-Phase Liquid Chromatography. In: Encyclopedia of Analytical Chemistry. American Cancer Society; 2006. doi:10.1002/9780470027318.a5913

4. Ibrahim D, Ghanem A. Sub-2 μm Silica Particles in Chiral Separation. New Uses of Micro and Nanomaterials, IntechOpen. doi: 10.5772/intechopen.79063

5. Stoll DR, Carr PW. Two-Dimensional Liquid Chromatography: A State of the Art Tutorial. Anal Chem. 2017;89(1):519-531. doi:10.1021/acs.analchem.6b03506

6. Miliauskas G, van Beek TA, de Waard P, Venskutonis RP, Sudhölter EJR. Comparison of analytical and semi-preparative columns for high-performance liquid chromatography-solid-phase extraction-nuclear magnetic resonance. J Chromatogr A. 2006;1112(1-2):276-284. doi:10.1016/j.chroma.2005.11.059