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明膠作為生物醫(yī)用材料具有生物相容性、低免疫原性、生物降解性和易操作性等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，各種明膠微球（GMS）的制備技術(shù)不斷創(chuàng)新，成為藥物、遺傳物質(zhì)和有益細(xì)菌的緩釋載體。此外，GMS在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中作為細(xì)胞載體和三維支架材料具有廣闊的應(yīng)用前景，具有良好的可注射性。通過(guò)這篇文章我們來(lái)學(xué)習(xí)一下，近年來(lái)GMS的制備方法，在生物醫(yī)藥上的應(yīng)用進(jìn)展（見(jiàn)圖1）及今后的研究方向。

隨著生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、藥學(xué)等基礎(chǔ)研究的迅速發(fā)展，人類(lèi)對(duì)再生醫(yī)學(xué)以及癌癥、栓塞、炎癥等疾病的發(fā)病機(jī)制有了更深入的認(rèn)識(shí)。現(xiàn)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一系列針對(duì)不同部位的藥物遞送系統(tǒng)，微球（microspheres）是指藥物分散或被吸附在高分子聚合物基質(zhì)中而形成的微小球狀實(shí)體，其粒徑一般在1-250μm之間，已逐漸成為新型藥物釋放系統(tǒng)的必要組成部分。微球制劑具有長(zhǎng)效緩控釋或靶向作用，可以大大提升患者用藥的方便性、依從性。同時(shí)，為了滿足組織工程和再生醫(yī)學(xué)對(duì)細(xì)胞載體和支架的新要求，微球從小到大，從固體到空心多孔結(jié)構(gòu)都表現(xiàn)出了顯著的多功能性。之前的研究表明，GMSs不僅可以為細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖創(chuàng)造豐富的界面，而且可以使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和各種趨化因子擴(kuò)散，同時(shí)微球可以與增殖的細(xì)胞整合成一個(gè)整體結(jié)構(gòu)。另外，可注射性是微球的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)，可以很容易地植入患者體內(nèi)，以治療各種不同部位疾病。

明膠是一種天然聚合物，是膠原部分水解后的產(chǎn)物。由于其良好的生物相容性、適當(dāng)?shù)纳锝到庑?、無(wú)毒性和非抗原性，明膠基球體在生物醫(yī)學(xué)方面得到了廣泛的應(yīng)用。例如，物理交聯(lián)的GMS已被用作制備多孔水凝膠的成孔劑；由此產(chǎn)生的空腔不僅為細(xì)胞生長(zhǎng)提供空間，而且增強(qiáng)水凝膠的滲透性，促進(jìn)細(xì)胞增殖和新組織形成。此外，物理交聯(lián)的GMS可以作為細(xì)胞傳遞的犧牲載體。由明膠和其他天然或合成聚合物制備的化學(xué)交聯(lián)GMS也表現(xiàn)出理想的性能，用于支架，生物活性因子和抗癌藥物，腫瘤栓塞，膠囊殼，組織工程中的三維支架系統(tǒng)。此外，為了促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)以及藥物和生物因子的擴(kuò)散，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多孔GMS以增強(qiáng)組織工程中的細(xì)胞增殖，并為藥物和因子提供新的給藥釋放系統(tǒng)。

圖1 明膠微球的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

1 明膠微球的制備

GMS的制備方法主要包括乳化交聯(lián)、電噴霧、噴霧干燥和微流控乳化等方法。其中，乳化交聯(lián)是制備GMSs研究最多的方法。該方法首先在攪拌下將溶解于水中的明膠溶液倒入油相中，然后通過(guò)在冰浴中冷卻（物理交聯(lián)）和/或使用化學(xué)試劑（例如1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS））交聯(lián)，甘氨酰氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）、戊二醛和京尼平（見(jiàn)圖2）。化學(xué)交聯(lián)不僅提高了GMSs的熱穩(wěn)定性，而且提高了GMSs的力學(xué)性能。對(duì)于乳化交聯(lián)形成的GMS，可通過(guò)調(diào)整有機(jī)溶劑和表面活性劑以及油的種類(lèi)和濃度、攪拌速度等制備條件，將其粒徑從10μm調(diào)整到400μm。乳化交聯(lián)法是一種低成本的GMS制備方法，同時(shí)所制備的GMS粒徑分布小。但該方法仍存在一些不足之處，例如難以擴(kuò)大到產(chǎn)業(yè)規(guī)模。此外，應(yīng)徹底清除GMS中的殘余油、交聯(lián)劑和表面活性劑，否則會(huì)對(duì)細(xì)胞和組織造成毒性。

圖2 乳化交聯(lián)法制備GMS的示意圖

制備GMS的另一種方法電噴霧（圖4），是基于類(lèi)似的靜電紡絲原理。微球的大小可以通過(guò)改變?cè)O(shè)置參數(shù)來(lái)調(diào)整，例如電壓、注入速度、針頭大小和接地導(dǎo)電表面。將正電荷或負(fù)電荷施加到針或收集基板上以產(chǎn)生幾千伏（kV）的電位差，從而在針的孔口處形成泰勒錐。在單軸（單針）噴涂中，所有噴涂成分將在整個(gè)過(guò)程中混合。同樣，在電噴霧中泰勒錐形成射流的過(guò)程中，參數(shù)的變化會(huì)導(dǎo)致射流破碎成液滴，從而產(chǎn)生不同大小和形狀的顆粒。通過(guò)電噴霧獲得的微球具有較高的負(fù)載效率，不需要表面活性劑處理。在多軸噴霧中，單一溶液在進(jìn)入泰勒錐之前不會(huì)混合。因此，可以制備核殼微球。

圖3電噴霧法制備GMS的示意圖

噴霧干燥是通過(guò)在高溫氣體介質(zhì)中霧化噴霧將溶液、懸浮液或乳液轉(zhuǎn)化為干粉的過(guò)程。主要用于食品和制藥行業(yè)（見(jiàn)圖4）。這種技術(shù)可以處理大量的溶液，而且相對(duì)便捷。明膠對(duì)溫度敏感，因此溫度控制是影響GMS形成的關(guān)鍵因素。使用Buchi B-90納米噴霧干燥器可以很容易地制備直徑為5–15μm的GMS。噴霧干燥技術(shù)已用于制備具有特定粒徑的微球，用于胰島素等藥物的肺部給藥。此外，微球的形成還受到工藝參數(shù)的影響，包括進(jìn)風(fēng)溫度、聚合物濃度、表面活性劑、交聯(lián)劑、出口溫度、霧化壓力、風(fēng)量、進(jìn)液速率等。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)對(duì)納米封裝技術(shù)的需求，納米噴霧干燥技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為實(shí)現(xiàn)納米級(jí)藥物制備的一種手段。納米噴霧干燥法可制備納米級(jí)超細(xì)粉體，并可大量生產(chǎn)。納米噴霧干燥與超霧化相結(jié)合是一種很有前途的技術(shù)，可以產(chǎn)生具有精確顆粒特性的GMS。該方法制備的GMS具有球形均勻、包封率高等特點(diǎn)。

圖4 噴霧干燥制備GMS示意圖

微流控技術(shù)由于不需要專門(mén)的設(shè)備而越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于GMS的制備。它可以產(chǎn)生具有廣泛粒徑范圍（20–1100μm）的均勻GMS。此外，近年來(lái)有學(xué)者將微流控技術(shù)與3D打印技術(shù)相結(jié)合，利用注射泵、收集容器、聚二甲基硅氧烷微流控裝置制備出均勻的微球。

2 明膠微球在生物醫(yī)藥的應(yīng)用

2.1 細(xì)胞的傳遞和培養(yǎng)

微膠囊技術(shù)是一種快速發(fā)展的技術(shù)，能夠?qū)⒓?xì)胞包封成微球（見(jiàn)圖5）。在先前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)負(fù)載克隆小鼠顱骨前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）的GMS，細(xì)胞在GMS之間的空隙中快速增殖。在另一項(xiàng)研究中，作者用可降解的載有成骨蛋白-2（BMP2）的GMS培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞。兩項(xiàng)研究都表明GMSs能增強(qiáng)ATP活性和新骨形成。此外，GMSs被用于MC3T3-E1的遞送以修復(fù)顱骨缺損，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)負(fù)載MC3T3-E1的GMSs可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和骨再生。降解的GMS促進(jìn)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滲透到細(xì)胞聚集體中，改善細(xì)胞存活、增殖以及分化。此外，一項(xiàng)研究表明，巨噬細(xì)胞可以介導(dǎo)GMSs的降解，并且可以時(shí)空控制GMSs負(fù)載的BMP2的釋放，進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）成骨。通過(guò)注射實(shí)現(xiàn)受損組織的修復(fù)，GMS載體不僅可以提供細(xì)胞粘附界面，還可以防止細(xì)胞丟失。Nicola等人的研究結(jié)果表明，GMS對(duì)體外共培養(yǎng)的L929成纖維細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，同時(shí)，細(xì)胞在GMS上粘附并增殖。GMSs釋放的細(xì)胞可以在組織培養(yǎng)皿上再次定居和增殖，這一現(xiàn)象證明了GMSs細(xì)胞復(fù)合物在體內(nèi)有助于傷口愈合的可能性。負(fù)載生長(zhǎng)因子的GMS -透明質(zhì)酸半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠在體外和體內(nèi)促進(jìn)MSC和鼻軟骨細(xì)胞（NC）的生長(zhǎng)和軟骨細(xì)胞分化。2019年，Shirin等人將大鼠胚胎成肌細(xì)胞系（H9C2）包埋到海藻酸鈉明膠微球中，H9C2不僅表現(xiàn)出高活力，而且保持了多功能性。

圖5 GMS負(fù)載細(xì)胞示意圖

近年來(lái)，GMSs與3D細(xì)胞支架的聯(lián)合應(yīng)用越來(lái)越受到人們的關(guān)注，GMSs作為細(xì)胞或生長(zhǎng)因子的載體。在之前的研究中，我們將軟骨細(xì)胞包裹在物理交聯(lián)的GMSs中，然后將其植入海藻酸鈉水凝膠中修復(fù)軟骨缺損。GMS作為軟骨細(xì)胞的運(yùn)輸載體，為軟骨細(xì)胞的增殖和ECM生成創(chuàng)造了生存空間。在一項(xiàng)研究中，將人骨髓結(jié)構(gòu)細(xì)胞（hBMSCs）包埋到GMS中，然后將負(fù)載細(xì)胞的GMS組裝到聚己內(nèi)酯（PCL）軟骨支架中再生。

2.2 藥物和生物活性因子的傳遞

GMS作為藥物和生物活性因子（BFs）的載體越來(lái)越受到重視（圖6）。它們可以提高其生物利用度和穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)靶向給藥到特定的身體部位，并延長(zhǎng)或控制釋放。此外，藥物的緩釋將減少其副作用，特別是對(duì)化療藥物的副作用。因此，研究學(xué)者們研究了一系列嵌入GMS的藥物來(lái)治療多種疾病。例如，最近的一項(xiàng)研究表明，載頭孢喹肟的GMS在靶組織中最大程度地釋放藥物，正常組織損傷自然消失。負(fù)載萬(wàn)古霉素的GMS也顯示出良好的持續(xù)釋放性能和對(duì)金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽(yáng)性）的抗菌活性。癌癥的治療一直是人類(lèi)關(guān)注的問(wèn)題，而化療仍然是最有效的治療方法。然而，傳統(tǒng)的給藥方法仍存在許多缺點(diǎn)，如副作用大。為了減少抗癌藥物的副作用，具有降解性能的GMS被用作腫瘤治療的藥物載體。采用乳液交聯(lián)法制備了5-氟尿嘧啶磁性微球（5-Fu/MGMS）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合GMSs具有良好的性能，在體外具有緩釋作用，在生理?xiàng)l件下具有良好的自愈能力。同樣，順鉑（CDDP）是治療胃腸道和婦科癌癥最有效的藥物之一，負(fù)載CDDP的GMS用于治療腹膜癌，減少藥物損失和副作用。它們顯著降低了體重減輕，腎毒性和血液毒性等副作用。用GMS構(gòu)建物治療的小鼠比用游離CDDP治療的小鼠壽命更長(zhǎng)，用GMS構(gòu)建物治療的小鼠體重沒(méi)有減輕，而用游離CDDP治療的小鼠體重減輕了約20%。與單用順鉑或?qū)φ战M相比，載順鉑GMS可延長(zhǎng)抗癌作用。卵巢癌是常見(jiàn)的婦科腫瘤，晚期卵巢癌患者有一定的復(fù)發(fā)概率，部分原因是腹腔接觸化療藥物時(shí)間有限。將紫杉醇納米混懸液負(fù)載于平均粒徑為283.7±1.2nm的京尼平明膠微球（PTXnano-GP-MS）可用于治療永久性癌病，并預(yù)防疾病復(fù)發(fā)。PTXnano-GP-MS顯示出優(yōu)越的抗癌效果，降低了腹膜癌變指數(shù)和腹水發(fā)生率。此外，還研究了姜黃素明膠/絲纖維素微球?qū)Φ庖宜徕c（MIA）誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎（OA）的治療作用，復(fù)合微球的包封率可達(dá)55-59%。結(jié)果表明姜黃素微球?qū)Υ笫驩A關(guān)節(jié)有潛在的抗炎作用，且微膠囊技術(shù)和粘膜粘附材料的使用可以提高姜黃素的釋放和生物利用度。

圖6 載入藥物(A)和生物活性因子(BFs) (B)的示意圖

另一方面，關(guān)于GMS作為BFs載體的各種研究也有報(bào)道，其中BFs（如酶、生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素）具有多種功能，如促進(jìn)組織再生、建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型等。GMS已被用作輸送不同生長(zhǎng)因子的治療劑，包括但不限于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、BMP2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）。為了負(fù)載BFs，通常在BFs溶液中對(duì)GMS進(jìn)行連續(xù)攪拌，然后通過(guò)快速過(guò)濾收集含有BFs的GMS，洗滌，最后冷凍干燥。研究表明，視網(wǎng)膜下植入含有bFGF4和IFNβ的GMS可使兔眼增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變修復(fù)。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）也被成功植入10μm的GMSs中修復(fù)面神經(jīng)。另一項(xiàng)研究表明，含有降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的GMSs在兔骨質(zhì)疏松性骨缺損模型中有效地促進(jìn)了成骨。由于創(chuàng)傷部位的炎癥和金屬卟啉（MMP）酶的活性，傷口不能在短時(shí)間內(nèi)愈合，為了解決這個(gè)問(wèn)題，Giriprasath等人設(shè)計(jì)了用負(fù)載鐵的GMS浸漬的膠原（Col）支架，提高了傷口愈合效率。此外，Tajima等人將被認(rèn)為是成骨因子之一的BMP2結(jié)合到GMSs中，以促進(jìn)細(xì)胞增殖和骨再生。

通過(guò)給大鼠腦卒中模型注射骨橋蛋白研究，發(fā)現(xiàn)將骨橋蛋白負(fù)裝于GMSs后，其釋放時(shí)間明顯延長(zhǎng)，MCAO梗死面積縮小，治療窗延長(zhǎng)。Antonio等人評(píng)價(jià)了GMSs對(duì)心力衰竭模型中VEGF和IGF-1釋放的影響，GMSs雙重輸送VEGF和IGF-1改善了左心室的收縮和舒張功能，促進(jìn)了成熟血管的形成。由葡聚糖和明膠制成的GMS被用于輸送IGF-1，以促進(jìn)牙周缺損處的新骨形成。

2.3 基因和細(xì)菌的傳遞

近年來(lái)，基因和RNA干擾治療受到越來(lái)越多的關(guān)注。DNA是一種聚陰離子大分子，可以靜電固定在陽(yáng)離子化明膠上形成靜電絡(luò)合物。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，可能編碼一種維持高活性的治療蛋白。因此，許多學(xué)者認(rèn)為將DNA包埋在微球上可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的釋放。一些研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒DNA隨著GMS的降解而緩慢釋放，從而延長(zhǎng)釋放時(shí)間。質(zhì)粒DNA也被負(fù)載到納米球中，被內(nèi)化到細(xì)胞中，隨著時(shí)間的推移降解以釋放質(zhì)粒DNA。一項(xiàng)研究表明，負(fù)載陽(yáng)離子化明膠和BMP2質(zhì)粒的支架可顯著促進(jìn)體內(nèi)骨形成。制備陽(yáng)離子化GMSs，將NK4質(zhì)粒注入荷瘤小鼠體內(nèi)，評(píng)價(jià)其抗腫瘤作用，結(jié)果表明，GMSs控釋可增強(qiáng)NK4質(zhì)粒的抗腫瘤作用。此外，表達(dá)VEGF的小干擾RNA（siRNA）的質(zhì)粒被嵌入GMSs中，GMSs-DNA復(fù)合物在體內(nèi)可抑制腫瘤生長(zhǎng)。此外，GMSs在基因和siRNA的口服給藥方面也顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)。

并非所有細(xì)菌都對(duì)人體有害；例如，乳酸桿菌菌株是最廣泛使用的口服益生菌，可改善胃腸（GI）功能和宿主健康?；贕MS的微囊化技術(shù)是一種很有前途的口服乳酸菌保護(hù)技術(shù)。GMS能夠保留細(xì)菌細(xì)胞，在特定條件下控制釋放。此外，微球的粒徑宜小于100μm，以減少副作用。越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始選擇明膠微球作為細(xì)菌載體。2016年，Hansen等人開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase）交聯(lián)GMS作為乳酸菌的運(yùn)載工具；GMS可在連續(xù)暴露60分鐘內(nèi)保護(hù)負(fù)載的乳酸菌免受模擬胃液（pH 2.0，37℃）的影響。同時(shí)，也可以提高乳酸桿菌在模擬腸液（ph7.4，37℃）中的存活率。以明膠和海藻酸鈉為原料，對(duì)枯草芽孢桿菌SL-13進(jìn)行包埋，制備新型殺菌劑。結(jié)果表明，負(fù)載的SL-13在25℃下儲(chǔ)存120天后仍保持高活性。

4結(jié)論和未來(lái)展望

GMS作為生物醫(yī)藥應(yīng)用中的運(yùn)載工具，經(jīng)歷了快速的發(fā)展。GMS不僅可以為細(xì)胞的粘附、增殖和分化提供高密度的界面，還可以作為支架材料，形成新組織形成的宏觀結(jié)構(gòu)。這些發(fā)現(xiàn)大大擴(kuò)展了它們?cè)诮M織工程中的應(yīng)用。此外，GMSs作為藥物和BFs的載體，可以保護(hù)它們免受胃腸道酸和酶降解等環(huán)境脅迫。在過(guò)去的幾年中，GMSs取得了巨大的進(jìn)展，但仍有一些關(guān)鍵問(wèn)題有待解決，如開(kāi)發(fā)生物相容性細(xì)胞包埋方法、控制其降解特性等。明膠和海藻酸鈉的聯(lián)合使用以及在CaCl2溶液中的快速凝膠化可以保持較高的細(xì)胞活力，但隨后的交聯(lián)過(guò)程往往會(huì)引起細(xì)胞毒性。因此，探索理想的交聯(lián)劑已成為開(kāi)發(fā)生物相容性細(xì)胞包封策略的關(guān)鍵步驟。GMSs的降解不僅會(huì)影響細(xì)胞增殖，而且會(huì)影響載藥和BFs的釋放。通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)劑的降解，可以控制GMS的降解規(guī)律。綜上所述，開(kāi)發(fā)合適的交聯(lián)劑對(duì)于制備細(xì)胞包封的GMS和制備降解速率可控的GMS具有重要意義。此外，在GMS內(nèi)形成孔隙應(yīng)是調(diào)整其降解曲線的另一種策略；同時(shí)，大量孔隙的建立可增強(qiáng)GMS載體的滲透性。此外，利用三維生物打印技術(shù)可以控制組織工程支架中GMS或載細(xì)胞GMS的大小和三維位置，這對(duì)組織工程復(fù)合組織的形成具有重要意義。