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為使人類免于使用醫(yī)療器械所產(chǎn)生的潛在生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)，國際標(biāo)準(zhǔn)、國家標(biāo)準(zhǔn)和指南都對各種醫(yī)療器械總體評價(jià)和開發(fā)過程的生物學(xué)評價(jià)提供了指導(dǎo)意見。而體外細(xì)胞毒性評價(jià)作為生物學(xué)評價(jià)中至關(guān)重要的一部分，常常為如何進(jìn)行下一步的生物學(xué)評價(jià)提供重要的指導(dǎo)作用。國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)、美國藥典(USP)等均為細(xì)胞毒性檢測建立了專門的評價(jià)方法(ISO 10993-5，ISO 7405，USP通則87)。本文與大家討論一下如何進(jìn)行產(chǎn)品的體外細(xì)胞毒性評價(jià)。

一、細(xì)胞毒性試驗(yàn)的目的?

細(xì)胞毒性試驗(yàn)的目的是為了評價(jià)產(chǎn)品或產(chǎn)品浸提液是否具有潛在的細(xì)胞毒性。

在進(jìn)行產(chǎn)品的體外細(xì)胞毒性評價(jià)時(shí)，需要滿足相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價(jià)的要求，以保證評價(jià)結(jié)果的充分性和有效性。

二、哪些產(chǎn)品需要進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價(jià)？

在了解如何進(jìn)行產(chǎn)品的體外細(xì)胞毒性評價(jià)前，我們需要先了解哪些產(chǎn)品需要進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價(jià)。

ISO 10993-1 按照器械的人體接觸性質(zhì)和接觸時(shí)間給出生物學(xué)評價(jià)的框架，我們來具體地了解一下需要進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價(jià)的器械有哪些。

三、如何選擇試驗(yàn)方法?

既然幾乎所有的產(chǎn)品都需要進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價(jià)，而標(biāo)準(zhǔn)中提供的評價(jià)方法是多種多樣的，我們應(yīng)當(dāng)如何從多種方法中選擇適宜產(chǎn)品的試驗(yàn)方法呢？要了解如何選擇試驗(yàn)方法，我們需要先了解試驗(yàn)方法有哪些。

a) 浸提液試驗(yàn)：浸提液試驗(yàn)是使用浸提介質(zhì)浸提樣品，然后通過浸提液與細(xì)胞接觸來評價(jià)細(xì)胞毒性的方法，本試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性和定量評定。

b) 直接接觸試驗(yàn)：直接接觸試驗(yàn)是通過樣品直接與細(xì)胞接觸來評價(jià)細(xì)胞毒性的方法。固體樣品可直接置于細(xì)胞層與細(xì)胞接觸，液體樣品可直接放置；或放置到生物惰性吸水性的基質(zhì)上與細(xì)胞接觸。本試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性和定量評定。

c) 間接接觸試驗(yàn)：間接接觸試驗(yàn)包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和濾膜擴(kuò)散試驗(yàn)。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是將樣品置于瓊脂層上，通過瓊脂層與細(xì)胞間接接觸來評價(jià)細(xì)胞毒性的方法，濾膜擴(kuò)散是將樣品置于無表面活性劑的濾膜，通過濾膜與細(xì)胞間接接觸來評價(jià)細(xì)胞毒性的方法。間接接觸試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性的定性評定。

在了解了不同的試驗(yàn)方法后，接下來讓我們繼續(xù)了解一下不同的產(chǎn)品在選擇評價(jià)方法時(shí)有哪些原則。

a) 可采用定性或定量的方法測定細(xì)胞毒性反應(yīng)。但細(xì)胞毒性的定量評價(jià)更好一些，定性方法適合篩選用途。因此在進(jìn)行成品醫(yī)療器械的生物學(xué)評價(jià)時(shí)，我們推薦使用定性的評價(jià)方法。

b) 在直接接觸試驗(yàn)中，各種形狀、尺寸或物理狀態(tài)(如液體、凝膠、固體等)的材料未經(jīng)修正即可進(jìn)行測試，固體材料首選樣品宜至少有一個(gè)平面，如無平面則應(yīng)修整出平面，該平面需確保覆蓋細(xì)胞層表面約十分之一。

c) 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)不適用于不能通過瓊脂層擴(kuò)散或可能與瓊脂相互作用的可瀝濾物，使用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞毒性評定時(shí)，委托人需要有充分的理由來證明可瀝濾物能通過瓊脂層擴(kuò)散，且與瓊脂不會(huì)發(fā)生相互作用。

d) 對于口腔醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性評價(jià)，ISO建立了專門的標(biāo)準(zhǔn)(ISO 7405)，其中給出了瓊脂擴(kuò)散和濾膜擴(kuò)散兩種指導(dǎo)方法。

四、怎么樣判定產(chǎn)品或產(chǎn)品的浸提液是否存在潛在的細(xì)胞毒性呢?

前邊我們介紹了不同試驗(yàn)方法，不同的試驗(yàn)方法結(jié)果判定的準(zhǔn)則也是不同的，下面我們就為大家逐一列舉一下。

?定量評價(jià)是測定細(xì)胞的死亡、生長抑制、細(xì)胞增殖或集落形成?？梢杂每陀^的方法對細(xì)胞數(shù)量、蛋白總量、酶的釋放、活體染料的釋放、還原等可測定的參數(shù)進(jìn)行定量測試。細(xì)胞活性下降大于30%被認(rèn)為是有細(xì)胞毒性反應(yīng)的。以MTT法為例，當(dāng)100%浸提液的存活率下降到小于空白的70%，則認(rèn)為產(chǎn)品浸提液是具有潛在細(xì)胞毒性的。

?定性評價(jià)是使用顯微鏡檢查細(xì)胞，評價(jià)細(xì)胞在一般形態(tài)、空泡形成、脫落、細(xì)胞溶解和胞膜完整性等方面的改變，并描述性地或以數(shù)字分級，來記錄正常的形態(tài)變化。下面列舉了兩種細(xì)胞毒性分級的方法，當(dāng)分級大于2級時(shí)被認(rèn)為有細(xì)胞毒性作用。

五、細(xì)胞毒性評價(jià)注意事項(xiàng)

在進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價(jià)的過程中有各種各樣的注意事項(xiàng)，我們進(jìn)行了總結(jié)分類，并分享給大家。

?試驗(yàn)樣品的注意事項(xiàng)：

a) 應(yīng)考慮試驗(yàn)樣品的無菌性，試驗(yàn)樣品如取自非無菌供應(yīng)但在使用前滅菌的器械，應(yīng)規(guī)定適宜的滅菌方式對樣品滅菌后進(jìn)行試驗(yàn)，規(guī)定的滅菌方式宜考慮滅菌方法或滅菌劑對產(chǎn)品的影響。

b) 如取自不需要滅菌的器械，則應(yīng)在供應(yīng)狀態(tài)下使用。為了避免細(xì)胞培養(yǎng)的微生物污染，對試驗(yàn)材料進(jìn)行滅菌或許是合理的，但滅菌過程不應(yīng)改變材料的性能。

c) 對吸水性試驗(yàn)樣品，如果適宜，試驗(yàn)前應(yīng)用培養(yǎng)基將其浸透，以防止其吸收試驗(yàn)器皿中的培養(yǎng)基。

?測試過程的注意事項(xiàng)：

a) 當(dāng)浸提介質(zhì)采用水等非生理浸提介質(zhì)時(shí)，浸提液用培養(yǎng)基稀釋后應(yīng)在最高生理相容性濃度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。推薦使用高濃度的(如2倍、5倍)培養(yǎng)基稀釋非生理浸提液。

b) 使用浸提液試驗(yàn)和直接接觸試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞毒性評價(jià)，浸提液與細(xì)胞接觸的時(shí)間應(yīng)不少于24小時(shí)。使用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞毒性評價(jià)，樣品與細(xì)胞間接接觸的時(shí)間應(yīng)在24~72小時(shí)。

?標(biāo)準(zhǔn)變更帶來的浸提時(shí)間的改變

ISO 10993-12標(biāo)準(zhǔn)升版之后，長期(>24小時(shí)，<30天)和持久(>30天)接觸的樣品在進(jìn)行細(xì)胞毒性評價(jià)時(shí)，推薦的浸提時(shí)間是72小時(shí)，因?yàn)榻?4小時(shí)可能不足以使那些使用超過24小時(shí)的器械上的化學(xué)物質(zhì)充分釋放。