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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2021-04-26 10:18
一、方法學(xué)驗(yàn)證的目的及意義
1. 目的：分析方法的驗(yàn)證是為了證明該分析方法與其預(yù)期目的相適應(yīng)。
2. 需驗(yàn)證的分析方法類型
① 鑒別試驗(yàn)
② 雜質(zhì)的定量試驗(yàn)
③ 雜質(zhì)控制的限度試驗(yàn)
④ 原料藥或制劑中活性成分以及制劑中選定組分的定量試驗(yàn)。
試驗(yàn)類型如下：
① 鑒別試驗(yàn)旨在確證樣品中的一種被測(cè)物的特性。通常將樣品的性質(zhì)（如光譜、色譜行為、化學(xué)反應(yīng)性等） 與參比對(duì)照品的性質(zhì)進(jìn)行比對(duì)。
② 雜質(zhì)檢查是指樣品中雜質(zhì)的定量檢測(cè)或限度檢測(cè)，兩種檢測(cè)均是為了準(zhǔn)確反映樣品的純度。定量試驗(yàn)所需驗(yàn)證項(xiàng)目與限度試驗(yàn)相比是不同的。
③ 含量測(cè)定是指測(cè)定樣品中被分析物的含量。本文件中含量測(cè)定是指原料藥中主要成分的定量測(cè)定。類似的驗(yàn)證項(xiàng)目也適用于制劑中的活性組分或其他指定成分的定量測(cè)定，以及與其他分析方法（如溶出度）相關(guān)的定量分析。
3. 應(yīng)清楚了解分析方法的目的，因?yàn)檫@將決定需要評(píng)價(jià)哪些驗(yàn)證項(xiàng)目。應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)的典型的驗(yàn)證項(xiàng)目如下：專屬性、檢測(cè)限、定量限、線性與范圍、精密度（進(jìn)樣精密度、重復(fù)性、中間精密度）、準(zhǔn)確性。
二、哪些情況需重新驗(yàn)證
① 原料藥合成方法的改變
② 成品組分發(fā)生改變
③ 分析方法的改變
需要重新驗(yàn)證的程度，應(yīng)根據(jù)改變的情況而定。某些其他的改變可能也要求驗(yàn)證。
注意：-表示該項(xiàng)目通常不需評(píng)價(jià)
+表示該項(xiàng)目通常需評(píng)價(jià)
(1) 假如已評(píng)價(jià)重現(xiàn)性（見(jiàn)術(shù)語(yǔ)表），可不需再評(píng)價(jià)中間精密度；
(2) 缺乏專屬性的分析方法，應(yīng)由其他分析方法來(lái)做補(bǔ)充；
(3) 有些情況下需要。
三、分析方法學(xué)驗(yàn)證各項(xiàng)目的定義及其要求
1. 專屬性（Specificity）專屬性是指可能存在某些組分(如雜質(zhì)、降解物、基質(zhì)等)時(shí)，對(duì)被分析物準(zhǔn)確可靠測(cè)定的能力。
專屬性有以下含義：
① 鑒別：確證被分析物符合其特性。
② 純度檢查：確保采用的分析方法可檢出被分析物中雜質(zhì)的準(zhǔn)確含量，如有關(guān)物質(zhì)、重金屬、溶劑殘留量等。
③ 含量測(cè)定（含量或效價(jià)）：提供樣品中被分析物的含量或效價(jià)的準(zhǔn)確結(jié)果。
專屬性注意事項(xiàng)：
(1) 定位分離試驗(yàn)
① 主峰峰純度的確定
在專屬性驗(yàn)證的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，主成分峰都應(yīng)該考察峰純度，確認(rèn)主成分峰為單一成分的峰。具體做法是用DAD檢測(cè)器進(jìn)行峰純度掃描或者用LC-MS確認(rèn)沒(méi)有其他成分。
② 稀釋劑
應(yīng)考察稀釋劑對(duì)被測(cè)物的干擾，空白稀釋劑出的峰應(yīng)不干擾被測(cè)物。具體做法是按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的進(jìn)樣量進(jìn)樣空白稀釋劑，記錄色譜圖。
③ 輔料
取質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定量的供試品中等量的空白輔料，按照規(guī)定分析處理，記錄色譜圖，空白輔料峰應(yīng)不干擾被測(cè)物。
④ 有關(guān)物質(zhì)
有關(guān)物質(zhì)分為兩大塊：工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)。如果在二者均可獲得的情況下，將雜質(zhì)分別定位，并配制一份混合溶液，根據(jù)檢測(cè)內(nèi)容的不同分別研究。含量測(cè)定各雜質(zhì)峰應(yīng)不干擾主成分的檢測(cè)，即各雜質(zhì)峰應(yīng)和主成分峰達(dá)成基線分離，各雜質(zhì)峰之間沒(méi)有要求，重疊也無(wú)妨，因?yàn)楹繙y(cè)定只需確認(rèn)主成分峰不受干擾即可。有關(guān)物質(zhì)中各雜質(zhì)峰和主成分峰之間的分離度均應(yīng)符合要求，一般不小于1.5。特殊情況可將某些雜質(zhì)合并控制，如互為對(duì)映異構(gòu)體的非對(duì)映異構(gòu)體，它們?cè)诜聪嗌V法中一般都是重疊的峰。
如降解雜質(zhì)不可獲得，應(yīng)進(jìn)行酸堿氧化破壞條件下考察可能的降解雜質(zhì)的干擾，該實(shí)驗(yàn)一般都做，但不是必須做，如果已經(jīng)對(duì)降解雜質(zhì)有了充分的研究，就無(wú)需做破壞實(shí)驗(yàn)。例如已經(jīng)有了有效期內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定性的研究結(jié)果，確認(rèn)了穩(wěn)定性期間的實(shí)際降解雜質(zhì)。因?yàn)橛行┣闆r下，破壞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不是真實(shí)可能的降解雜質(zhì)，這種情況以雙氧水進(jìn)行氧化破壞最為常見(jiàn)，破壞產(chǎn)物雜亂無(wú)章，甚至有可能因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)推翻分析方法。
(2) 強(qiáng)制降解試驗(yàn)
取本品分別在以下條件進(jìn)行破壞降解試驗(yàn)：
圖片
注意：酸、堿和雙氧水溶液濃度和放置時(shí)間均可以根據(jù)破壞情況進(jìn)行調(diào)整，如某個(gè)條件有降解傾向，應(yīng)調(diào)節(jié)條件使破壞至5%-20%之間。如三者均未發(fā)現(xiàn)降解傾向，再放置一段時(shí)間如10天，依然如此，既可說(shuō)明本化合物非常穩(wěn)定，穩(wěn)定性期間應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生降解雜質(zhì)。
① 峰純度
各條件下的峰純度應(yīng)符合要求。
② 分離度
含量測(cè)定方法各破壞產(chǎn)物應(yīng)與主成分達(dá)成基線分離，有關(guān)物質(zhì)方法各破壞產(chǎn)物與主成分之間的分離度均應(yīng)不小于1.5，各雜質(zhì)之間的分離度均應(yīng)不小于1.0。
③ 質(zhì)量守恒
有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法需要做質(zhì)量守恒的驗(yàn)算，應(yīng)評(píng)估主成分減少的量與雜質(zhì)增加的量的一致性。理論上如主成分減少10%，雜質(zhì)應(yīng)增加10%，才能說(shuō)明有關(guān)物質(zhì)方法能準(zhǔn)確檢出所有的降解雜質(zhì)。如二者不一致，則證明方法有缺陷，或?yàn)榻到怆s質(zhì)未檢出，或?yàn)榻到怆s質(zhì)研究不充分，因?yàn)闆](méi)有獲得主要降解雜質(zhì)的對(duì)照品，不清楚主要降解雜質(zhì)的校正因子。
④ 質(zhì)量守恒計(jì)算方法
如主成分峰在線性范圍內(nèi)，可將供試品溶液的主峰峰面積和校正后的總雜質(zhì)峰面積之和A除以與破壞后的溶液主峰峰面積和校正后的總雜質(zhì)峰面積之和A破，其限度應(yīng)在98%-102%之間。即A供/A破的值應(yīng)在98%-102%之間。制定此限度的依據(jù)是藥典液相系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)樣5針，允許RSD不大于2%，也即數(shù)據(jù)2%以內(nèi)的誤差可以歸屬為儀器引入。
如主成分不在線性范圍內(nèi)，則可測(cè)定供試品溶液和破壞后的溶液的主成分含量和有關(guān)物質(zhì)，含量減少值除以有關(guān)物質(zhì)增加值，限度應(yīng)在90%-110%之間。制定這個(gè)依據(jù)源自校正因子0.9-1.1之間都可不加校正因子計(jì)算有關(guān)物質(zhì)，表明雜質(zhì)結(jié)果允許10%的誤差。
以上兩個(gè)限度非官方規(guī)定，為合理限度，僅供參考，實(shí)際工作中可根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)整，本文中涉及的大部分?jǐn)?shù)字都是如此。
⑤ 如何確定哪個(gè)降解產(chǎn)物需要進(jìn)行鑒定？
建議在每個(gè)強(qiáng)制條件下降解的主要降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，一個(gè)“經(jīng)驗(yàn)規(guī)則”是對(duì)超過(guò)總降解產(chǎn)物10%的物質(zhì)進(jìn)行鑒定，因此，如果藥物降解10%，單個(gè)降解產(chǎn)物相對(duì)主藥降解3%，占總降解產(chǎn)物的30%，這個(gè)降解產(chǎn)物需鑒定，或者，如果藥物降解10%，單個(gè)降解產(chǎn)物相對(duì)主藥降解0.8%，僅占總降解產(chǎn)物的8%，這個(gè)降解產(chǎn)物不需鑒定，見(jiàn)PhRMA的“現(xiàn)有指導(dǎo)和最佳實(shí)踐”等文獻(xiàn)，最近PhRMA白皮書(shū)文件提出了類似方法作為確定強(qiáng)制降解試驗(yàn)中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的算法，該白皮書(shū)結(jié)合ICHQ3A 和Q3B中的鑒定限給出了強(qiáng)制降解試驗(yàn)中降解產(chǎn)物的鑒定限。見(jiàn)下表：
⑥ 補(bǔ)充說(shuō)明
降解實(shí)驗(yàn)可以有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定同時(shí)做，二者可以共用同一份破壞樣品，減少工作量，一般來(lái)說(shuō)有關(guān)物質(zhì)的供試品濃度大于含量測(cè)定，可以將有關(guān)物質(zhì)破壞后的溶液稀釋至含量測(cè)定規(guī)定濃度。具體如何操作請(qǐng)讀者諸君自己設(shè)計(jì)。
2. 檢測(cè)限（Detectionlimit）
某一分析方法的檢測(cè)限度是指樣品中的被分析物能夠被檢測(cè)到的最低量，但不一定要準(zhǔn)確定量。
檢測(cè)限注意事項(xiàng)：
檢測(cè)限溶液可以由母液稀釋直接考察信噪比，在2-4范圍內(nèi)即可。也可由公式LOD=3.3×STEYX/斜率計(jì)算得出檢測(cè)項(xiàng)濃度。
3. 定量限（Quantitationlimit）
定量限度是指在合適的準(zhǔn)確性和精密度下，能夠定量測(cè)定樣品中被分析物的最低量。它是樣品中含量低的化合物定量測(cè)定的參數(shù)，特別適用于雜質(zhì)和/或降解產(chǎn)物的測(cè)定。
定量限注意事項(xiàng)：
其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。從這一概念出發(fā)，應(yīng)確定信噪比為10的供試品的濃度是理所當(dāng)然的。然而響應(yīng)情況隨著儀器與流動(dòng)相的不同而不同，在方法驗(yàn)證時(shí)所選儀器與流動(dòng)相得出的信噪比為10的供試品的濃度不具有普遍意義上的代表性，這只是一個(gè)偶然值。我們?cè)趯?shí)際工作中其實(shí)無(wú)需確定信噪比為10的供試品的濃度，只需證明方法需定量的限度的合理性。以下舉例說(shuō)明：若方法報(bào)告限規(guī)定為0.05%，那么肯定需要證明此限度能準(zhǔn)確定量，如不能準(zhǔn)確定量，則此項(xiàng)規(guī)定不合理。我們可以稀釋制成0.01%的相應(yīng)溶液，注入儀器檢測(cè)，其信噪比如大于10，則證明方法有合理的定量限。無(wú)需費(fèi)時(shí)費(fèi)力找出每個(gè)雜質(zhì)的信噪比10的濃度，特別是已知雜質(zhì)數(shù)量較多的情況下，工作量將極為巨大。直接稀釋至特定濃度考察信噪比，則非常簡(jiǎn)單，只需將線性驗(yàn)證項(xiàng)下的混合雜質(zhì)溶液稀釋至目標(biāo)濃度即可。
還有一種簡(jiǎn)單的計(jì)算LOQ的方法就是根據(jù)線性驗(yàn)證的結(jié)果計(jì)算，公式為L(zhǎng)OQ=10×STEYX/斜率，STEYX為線性數(shù)據(jù)的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差，可以用EXCEL直接算出這個(gè)值。
4. 精密度（Precision）
分析方法的精密度指的是規(guī)定條件下對(duì)均質(zhì)樣品多次取樣進(jìn)行一系列檢測(cè)結(jié)果的接近程度（離散程度）。精密度可以從三個(gè)層次考慮：進(jìn)樣精密度、重復(fù)性、中間精密度。分析方法的精密度通常以多次測(cè)量結(jié)果的變異性、標(biāo)準(zhǔn)偏差或變異系數(shù)來(lái)表達(dá)。
4.1 進(jìn)樣精密度
主要用來(lái)考察儀器進(jìn)樣分析的精密程度。
進(jìn)樣精密度注意事項(xiàng)：
4.2 重復(fù)性（Repeatability）
重復(fù)性是指在同樣的操作條件下，在較短時(shí)間間隔的精密度：也稱為批內(nèi)精密度（Intra-assayprecision）。
重復(fù)性注意事項(xiàng)：
4.3 中間精密度（Intermediate precision）
中間精密度是指試驗(yàn)室內(nèi)部條件改變，如：不同日、不同分析者、不同儀器等情況下的精密度。
中間精密度注意事項(xiàng)：
5. 線性與范圍（Linearity and Range）
分析方法的線性是指在給定的范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果與樣品中被分析物的濃度（量）成比例關(guān)系的能力。分析方法的范圍是指樣品中被分析物的較高濃度（量）和較低濃度（量）之間的一個(gè)區(qū)間，并已證實(shí)在此區(qū)間內(nèi)，該方法具有合適的準(zhǔn)確性、精密度和線性。
線性與范圍注意事項(xiàng)：
需要注意的是在有關(guān)物質(zhì)線性驗(yàn)證中，除面積歸一法之外，范圍不宜太寬，否則相關(guān)系數(shù)較差，截距較大。如果波長(zhǎng)較小，接近流動(dòng)相截止波長(zhǎng)，則流動(dòng)相本底吸收較大，則更要縮小線性驗(yàn)證的范圍。每個(gè)點(diǎn)峰面積為供試品實(shí)際的響應(yīng)值減去流動(dòng)相本底值。日常工作中應(yīng)該能發(fā)現(xiàn)在高流動(dòng)相本底吸收的低濃度下響應(yīng)遠(yuǎn)小于高濃度響應(yīng)除以相應(yīng)稀釋倍數(shù)的值，就是由于流動(dòng)相本底的影響。一般有關(guān)物質(zhì)線性范圍可以是限度的20%、50%、80%、100%、120%、150%。還需注意的是線性范圍應(yīng)包括準(zhǔn)確度的三個(gè)值。
6. 準(zhǔn)確度（Accuracy）
分析方法的準(zhǔn)確性指的是真實(shí)值或認(rèn)可的參考值與測(cè)量值之間相近程度。準(zhǔn)確性有時(shí)也稱真實(shí)度。
準(zhǔn)確度注意事項(xiàng)：
有關(guān)物質(zhì)準(zhǔn)確度的數(shù)據(jù)應(yīng)該按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定處理，例如質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為加校正因子的自身對(duì)照法，則應(yīng)該按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定計(jì)算各樣品溶液的雜質(zhì)含量，并計(jì)算回收率。偶見(jiàn)用外標(biāo)法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的回收率，而質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的是自身對(duì)照法。這背離了方法驗(yàn)證的本意，方法驗(yàn)證應(yīng)該驗(yàn)證方法自身的準(zhǔn)確度。如果用外標(biāo)法回收率合格，但線性驗(yàn)證出現(xiàn)問(wèn)題，校正因子計(jì)算不準(zhǔn)確，導(dǎo)致實(shí)際工作中檢測(cè)結(jié)果偏離真實(shí)值，而方法驗(yàn)證卻判斷符合要求，這明顯是不合理的。
7. 耐用性（Robustness）
分析方法的耐用性是指在試驗(yàn)參數(shù)被故意地發(fā)生細(xì)小改變時(shí)，檢測(cè)不受影響的能力，用于說(shuō)明正常使用時(shí)的可靠性。
(1) USP中關(guān)于耐用性試驗(yàn)考察的條件及范圍
① 等度條件
② 梯度條件
(2) EP中關(guān)于耐用性試驗(yàn)考察的條件及范圍
① 等度條件
② 梯度條件
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