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通常，建立響應(yīng)因子的過程需要使用單個(gè)雜質(zhì)的對照品。為了準(zhǔn)確測定，必須知道雜質(zhì)的純度，然后根據(jù)峰面積及濃度比計(jì)算響應(yīng)因子。

確定UV響應(yīng)因子可能的替代方法是使用兩個(gè)檢測器：標(biāo)準(zhǔn)的UV檢測器和另一個(gè)檢測器，其響應(yīng)與重量或濃度成正比。則該信息與UV峰面積相結(jié)合將提供所需的RRF信息，而無需純化雜質(zhì)樣品。如果有替代檢測器，人們可能會(huì)合理地質(zhì)疑是否需要紫外檢測器和RRF值，因?yàn)樗鼘⒅苯犹峁┯嘘P(guān)雜質(zhì)/母體相對含量的信息。但是，紫外線檢測器價(jià)格便宜，堅(jiān)固耐用且易于獲得。因此，一旦確定了RRF值，便可以廣泛應(yīng)用于沒有其他檢測器可用的情況。

（一）1H-NMR與HPLC-UV聯(lián)用確定RRF。

       該方法需要足夠的雜質(zhì)（通常大于10µg）才能獲得定量的1H-NMR譜圖。在NMR分析之前需要進(jìn)行色譜分離，確定雜質(zhì)的純度足夠高，以至于在母體藥物存在下無需分離即可獲得NMR光譜。將雜質(zhì)的NMR光譜與母體藥物在相同溶劑中的光譜進(jìn)行比較（兩種化合物都可在其中完全溶解）。然后選擇至少一種特定于每種化合物的NMR共振峰，以使這些峰被完全分辨并易于積分。理想情況下，從已知結(jié)構(gòu)中確定每個(gè)峰對應(yīng)的氫。但是，僅了解與每個(gè)峰相關(guān)的分子量和質(zhì)子數(shù)就足夠了。獲得雜質(zhì)和母體藥物的近似等摩爾混合物（在理想情況下）的NMR譜，并確定所選峰的面積。每個(gè)區(qū)域通過除以質(zhì)子數(shù)來歸一化。這些歸一化峰面積的比率（雜質(zhì)/母體）等于雜質(zhì)與母體的摩爾比。除去NMR管中的溶劑，并在HPLC流動(dòng)相中溶解。然后使用有關(guān)物質(zhì)的方法將該稀釋后的樣品溶液注入HPLC-UV中。需要注意的是獲得的峰面積在紫外檢測器的線性區(qū)域內(nèi)。對色譜峰進(jìn)行積分，并獲得給定波長下的峰面積比。最后，使用HPLC-UV和NMR峰面積比，質(zhì)子數(shù)和兩種物質(zhì)的分子量計(jì)算RRF。

       其中i =雜質(zhì)，p =母體化合物；＃H是與給定NMR峰相關(guān)的氫數(shù)，MW是分子量。

（二）蒸發(fā)光散射檢測（ELSD）與HPLC-UV聯(lián)用確定RRF。

       蒸發(fā)光散射檢測（ELSD）已被證明廣泛適用于非發(fā)色化合物的檢測。盡管它僅限于揮發(fā)性流動(dòng)相，但它價(jià)格便宜，相對堅(jiān)固，易于使用，并且可以結(jié)合到許多HPLC方法中。對于具有相似結(jié)構(gòu)和蒸氣壓的化合物，ELSD可以預(yù)期單位質(zhì)量的響應(yīng)相似。在這種情況下，可以將ELSD與紫外檢測器結(jié)合使用，以峰面積比確定RRF值：

       其中i =雜質(zhì)，p =母體化合物；

       上述公式的假設(shè)是ELSD峰面積與質(zhì)量成正比。然而，ELSD響應(yīng)取決于干燥時(shí)產(chǎn)生的顆粒的數(shù)量和性質(zhì)。對于結(jié)構(gòu)，電荷或蒸氣壓變化很大的化合物，或?qū)τ诹鲃?dòng)相組成變化的化合物（例如梯度HPLC），ELSD響應(yīng)可能會(huì)顯著變化。最后，ELSD信號與分析物的質(zhì)量不是線性的，因此校準(zhǔn)可能比使用UV吸光度檢測器更復(fù)雜。

（三）CAD與HPLC-UV聯(lián)用確定RRF。

       一種相對較新的檢測方法—帶電氣溶膠檢測（CAD），將洗脫的分析物轉(zhuǎn)化為細(xì)顆粒方面類似于ELSD。但是，CAD不會(huì)使用光散射，而是通過電暈放電將電荷施加到粒子上，并通過靜電計(jì)測量帶電粒子的數(shù)量。對于大多數(shù)非揮發(fā)性分析物，CAD比ELSD更為靈敏，并且具有更寬的動(dòng)態(tài)范圍。對于分析物的質(zhì)量，CAD響應(yīng)不是線性，而是二次方。同樣，響應(yīng)主要取決于顆粒大小，而不取決于分析物的結(jié)構(gòu)，只要它是不揮發(fā)的即可。與ELSD相比，CAD信號對顆粒性質(zhì)的依賴性較小，因此對于各種非揮發(fā)性成分，其響應(yīng)因子更加均勻。CAD與ELSD一樣堅(jiān)固且易于使用，并且在確定藥物降解產(chǎn)物的相對UV響應(yīng)因子方面顯示出了巨大的潛力。但是，分析物在所使用的條件下必須幾乎沒有蒸氣壓，以便給出一致的單位質(zhì)量響應(yīng)。同樣，流動(dòng)相組成的變化會(huì)促進(jìn)氣霧液滴形成的變化，從而引起CAD響應(yīng)的變化，就像ELSD一樣。通常，給定分析物的CAD信號隨著流動(dòng)相中有機(jī)相（相對于水溶液）比例的增加而增加。因此，相對于較早洗脫的梯度，梯度反相HPLC-CAD往往會(huì)加重較晚洗脫的峰。因此，不能假定整個(gè)梯度的峰面積與相對質(zhì)量或摩爾量直接相關(guān)。但是，可以通過將洗脫液1:1與來自第二相反梯度的洗脫液混合，然后再到達(dá)CAD來消除此錯(cuò)誤。以這種方式，有機(jī)/水比在整個(gè)運(yùn)行中在CAD處保持恒定。

（四）CLND與HPLC-UV聯(lián)用確定RRF。

       用于RRF測定含氮化合物的有用檢測器是化學(xué)發(fā)光氮特異性HPLC檢測器（CLND）。該檢測器基于HPLC流出物在富氧爐中的燃燒，將所有有機(jī)物轉(zhuǎn)化為碳，氮，硫等的氧化物和水。然后，由含氮化合物產(chǎn)生的一氧化氮與臭氧反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)的二氧化氮，該二氧化氮在返回基態(tài)時(shí)會(huì)發(fā)出光子。該化學(xué)發(fā)光響應(yīng)與一氧化氮的摩爾數(shù)成正比，并且相應(yīng)地與最初存在于分析物中的氮的摩爾數(shù)相對應(yīng)。對于幾乎任何含氮化合物（N 2和含N = N鍵的化合物除外），信號均與結(jié)構(gòu)無關(guān)。因此，胺，酰胺，硝酸鹽，含氮雜環(huán)等均產(chǎn)生與存在的氮的摩爾數(shù)直接相關(guān)的信號。只要已知分析物的分子式，就可以從HPLC峰中的氮含量確定其在樣品中的相對重量。

      因此，定量只需要一個(gè)含氮標(biāo)準(zhǔn)，不必與分析物在結(jié)構(gòu)上相關(guān)。此外，對于確定相對量，不需要任何標(biāo)準(zhǔn)。一旦找到相對量，就可以使用UV峰面積（例如，與CLND串聯(lián)的UV檢測器）來確定RRF，這很簡單。因此，可以通過以下公式確定雜質(zhì)相對于母體化合物的紫外線響應(yīng)因子（每單位重量）：

      其中i是雜質(zhì)，p是母體化合物，MW是分子量。＃N是分子式中的氮原子數(shù)。請注意，對于未知雜質(zhì)，可以使用高分辨率LC-MS來確定分子對于摩爾（而不是重量）RRF值，每個(gè)分子僅需要相對氮原子數(shù)，而無需分子量。

       由于CLND具有等摩爾性質(zhì)，因此無需餾分收集或純化，無需標(biāo)準(zhǔn)液甚至無需知道分析物的濃度即可獲得RRF信息。這大大簡化了樣品制備過程，并且雜質(zhì)的穩(wěn)定性也不成問題。

       當(dāng)然，CLND僅限于不含氮的流動(dòng)相。因此排除了常用于HPLC的乙腈和胺改性劑。此外，CLND在流動(dòng)相中不適用非揮發(fā)性緩沖鹽。但是，仍然可以確定在這些非CLND兼容HPLC條件下運(yùn)行的樣品的RRF值。在這種情況下，將使用兩步過程。首先，使用CLND兼容的流動(dòng)相（例如甲醇/水/三氟乙酸）分離目標(biāo)化合物，并在這些條件下確定RRF值（RRF 1）。另外，通過使用兩組HPLC條件（CLND除外）分析一個(gè)共同的樣品，比較了使用CLND兼容和不兼容HPLC條件獲得的UV峰面積。當(dāng)然，必須跟蹤目標(biāo)峰以避免錯(cuò)誤（例如，通過UV光譜比較）。然后，通過乘以在每種條件下獲得的相對UV面積的比率，可以使用通過CLND兼容方法獲得的相對響應(yīng)因子（RRF1）來確定不同條件集的相對響應(yīng)因子（RRF2）。

       其中i是雜質(zhì)，p是母體化合物，1和2分別表示CLND兼容和不兼容的HPLC條件。

       或者，可以使用CLND分析樣品以確定存在的分析物的相對量。然后，可以使用非CLND兼容的HPLC條件通過UV檢測分析相同的樣品，并使用等式計(jì)算RRF。該方法要求使用同一樣品定義非CLND兼容的HPLC條件并在CLND分析時(shí)運(yùn)行。相比之下，用等式描述的方法允許隨時(shí)從CLND移開的位置運(yùn)行單獨(dú)的樣品，盡管樣品必須在兩組HPLC條件下都進(jìn)行UV檢測。