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問：當(dāng)我運(yùn)行方法并測(cè)量色譜柱塔板數(shù)時(shí)，我的色譜柱塔板數(shù)約8000。但是生產(chǎn)商的文獻(xiàn)中色譜柱塔板數(shù)為13000。您能解釋這個(gè)差異嗎？

答：色譜柱的塔板數(shù)不是固定的。對(duì)于給定的色譜柱，塔板數(shù)取決于流速，溶劑的粘度和分析物的分子量。儀器也可能會(huì)影響，但我們暫時(shí)將其忽略。

色譜柱生產(chǎn)商已經(jīng)建立了標(biāo)準(zhǔn)化的條件，可以通過這些條件來檢查色譜柱的質(zhì)量。在反相色譜中，通常使用簡(jiǎn)單的疏水性分析物（例如甲苯，萘或苊）進(jìn)行測(cè)量。檢查這些化合物使用的流動(dòng)相含有大量的有機(jī)溶劑。因此它們具有低粘度。另一方面，大多數(shù)HPLC用戶正在處理更多極性化合物，這需要具有更高水含量的流動(dòng)相。這些流動(dòng)相具有較高的粘度。由于在正常HPLC條件下，隨著粘度的增加，塔板數(shù)會(huì)減少，因此在實(shí)際使用條件下，塔板數(shù)要比在柱測(cè)試條件下要低。

問：如果在正常使用條件下的塔板數(shù)低于生產(chǎn)商報(bào)告的塔板數(shù)，生產(chǎn)商是否會(huì)在色譜柱性能方面誤導(dǎo)用戶？

答：不是。這不是它的目的。生產(chǎn)商使用的色譜柱測(cè)試程序旨在檢查色譜柱的質(zhì)量，并且最好在色譜柱的塔板數(shù)達(dá)到或接近最大值的情況下完成此操作。這是柱填充技術(shù)影響最大的地方。因此，如果我要檢查包裝技術(shù)的質(zhì)量，這就是我要對(duì)其進(jìn)行測(cè)量的地方。

問：請(qǐng)多解釋一些原因，為什么塔板數(shù)會(huì)隨著流速，塔填料等的變化而變化！

答：塔板數(shù)對(duì)各種參數(shù)依賴性的根本原因是減小的板高，以及它對(duì)減小的流速的依賴性。我將對(duì)此略作概述，但是為了更深入地了解，我們需要看一本有關(guān)色譜的教科書。

色譜柱的塔板數(shù)是色譜柱長(zhǎng)度L除以降低的板高h(yuǎn)和粒徑dp：

柱長(zhǎng)和粒徑是固定的（已知）。減小的板高度取決于減小的速度，其定義如下：

這個(gè)方程包含線速度u，樣品在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)DM以及粒徑。大部分HPLC工作都是在降低的流度（在3到20之間）下進(jìn)行的。

文獻(xiàn)中有幾個(gè)方程式描述了減小的塔板高度對(duì)減小的速度的依賴性。在此處討論的速度范圍內(nèi)，它們給出相同的結(jié)果。因此，讓我使用最簡(jiǎn)單的一個(gè)，它基于van-Deemter方程：

該系數(shù)是經(jīng)驗(yàn)值，并且已從廣泛的數(shù)據(jù)庫中獲得了反相操作條件的系數(shù)。通過這種關(guān)系描述的曲線具有最小值，它以約2.5的降低速度達(dá)到。第一系數(shù)是填充均勻性的量度。因此，這取決于包裝過程。

Thecolumnplatecountdependsonthereducedvelocityas  follows:

色譜柱板塔數(shù)取決于降低的速度，如下所示：

因?yàn)镠ETP對(duì)速度的依賴性最小，所以塔板數(shù)對(duì)速度的依賴性最大。稍加演算就可以看出最大板數(shù)約為L(zhǎng) / 2.3 dp。因此，我們可以得出結(jié)論，填充5µm顆粒的15 cm色譜柱的最大板數(shù)為13000，是一個(gè)很好的色譜柱。

不良的色譜柱填充對(duì)方程式3的第一個(gè)系數(shù)有很大的影響，而其他的則保持大致相同。當(dāng)其他因素的影響最小時(shí)，此系數(shù)的影響最大。這就是為什么要在最大塔板數(shù)或接近最大板數(shù)的條件下測(cè)試色譜柱的原因。

現(xiàn)在讓我們解決您的問題的第二部分，塔板數(shù)對(duì)流量的依賴性。我通過降低速度來彌補(bǔ)這一點(diǎn)。首先，降低的速度與線速度成正比，線速度與流速成正比。因此，塔板數(shù)取決于流速。在非常低的流量下它是低的，而在高流量下它也是低的。最大塔板數(shù)介于兩者之間。但在哪里？從方程2中降低的速度的定義可以看出，降低的速度包括分析物在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)。從上面的結(jié)果我們知道，以2到3左右的速度降低出現(xiàn)最大塔板數(shù)。對(duì)于測(cè)試樣品中的疏水性分析物的色譜柱的流動(dòng)相通常為70/30（v / v）乙腈/水，對(duì)于5µm的色譜柱，這意味著線速度為1至1.5 mm / sec。對(duì)于內(nèi)徑為3.9mm的色譜柱，對(duì)應(yīng)于該線速度的流速約為0.5至0.7ml/min。對(duì)于內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，對(duì)應(yīng)于該線速度的流速約為0.7至1 ml/min。

由于曲線最小值的點(diǎn)取決于擴(kuò)散系數(shù)，因此我們需要知道擴(kuò)散系數(shù)與流動(dòng)相的關(guān)系。文獻(xiàn)中有一些方程式，這些方程式使我們能夠估計(jì)分析物在特定溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)（例如，Wilke-Chang方程式）。然而，對(duì)于當(dāng)前的討論，我們只需要知道擴(kuò)散系數(shù)與流動(dòng)相的粘度成反比：

這意味著發(fā)生最大塔板數(shù)的速度（或流速）隨粘度的增加而降低。70/30（ v / v）乙腈/水的流動(dòng)相的粘度為0.7 cP，而50/50（ v / v）甲醇/水的流動(dòng)相的粘度為1.8 cP。當(dāng)我們使用甲醇/水流動(dòng)相時(shí)，對(duì)于裝有5 µm顆粒的3.9 mm色譜柱，最佳流速降低至0.2-0.3 ml/min，而對(duì)于4.6 mm色譜柱，則降低至0.3至0.45 ml/min。在方法開發(fā)過程中，這一點(diǎn)值得牢記。

有一個(gè)有趣的方面擴(kuò)散系數(shù)對(duì)溶劑粘度有依賴性。改變流動(dòng)相組成時(shí)，可以使用以下經(jīng)驗(yàn)法則來估算色譜柱性能：在不同的流動(dòng)相中，相同的色譜柱在相同的背壓下將得到大約相同的塔板數(shù)。請(qǐng)記住一個(gè)有用的規(guī)則！