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有關(guān)物質(zhì)較含量測定而言是一個(gè)更加復(fù)雜和瑣碎的體系，含量測定僅要求準(zhǔn)確分析主成分，有關(guān)物質(zhì)旨在研究所有應(yīng)研究的雜質(zhì)。

然而，研究沒有那么容易，每個(gè)雜質(zhì)有它的脾氣 。

 

有關(guān)物質(zhì)的研究思路

 

研究思路這個(gè)部分，應(yīng)該由分析人員與合成人員共同討論商定。項(xiàng)目開展前期，討論會(huì)的頻率會(huì)比較高，研究思路可能也會(huì)隨著討論而發(fā)生很多變化。

 

1.合成路線

API的工藝路線是雜質(zhì)研究的關(guān)鍵，捋順工藝路線，可以清楚每個(gè)雜質(zhì)的來源和去向，更有針對性地給出雜質(zhì)控制的策略。比如，哪些雜質(zhì)可以僅在起始物料中分步被控制，后續(xù)API中無需再研究；比如，是否有些雜質(zhì)在工藝中一直會(huì)有產(chǎn)生的可能性，那么僅在終產(chǎn)品中控制才能將其完全控制住，在前幾步反應(yīng)的研究中僅對其進(jìn)行專屬性的研究即可。

Sofosbuvir (索磷布韋)工藝路線

 

2.雜質(zhì)譜分析

分析各工藝雜質(zhì)是從哪一步得來的，如何產(chǎn)生；分析各降解雜質(zhì)是由什么條件降解而來（要綜合前期降解試驗(yàn)結(jié)果而考慮），列出雜質(zhì)產(chǎn)生機(jī)理，然后再將雜質(zhì)信息匯總成表格，推薦格式如下：

 

雜質(zhì)限度的制定

 

ICH Q3A中關(guān)于原料藥的雜質(zhì)限度規(guī)定見下表：

最大日劑量	報(bào)告限度	鑒定限度	界定限度
≤2g	0.05%	0.10%或1.0mg（取最小值）	0.15%或1.0mg（取最小值）
>2g	0.03%	0.05%	0.05%

 

ICH Q3B中關(guān)于制劑的雜質(zhì)限度規(guī)定見下表：

報(bào)告限度	最大日劑量	≤1g		＞1g
	限度	0.1%		0.05%
鑒定限度	最大日劑量	＜1mg	1mg~10mg	＞10mg~2g	＞2g
	限度	1.0%或5μg （取最小值）	0.5%或20μg （取最小值）	0.2%或2mg （取最小值）	0.10%
界定限度	最大日劑量	＜10mg	10mg~100mg	＞100mg~2g	＞2g
	限度	1.0%或50μg （取最小值）	0.5%或200μg （取最小值）	0.2%或3mg （取最小值）	0.15%

 

根據(jù)參比制劑說明書或查找相關(guān)文獻(xiàn)，可得知藥品的最大日劑量，根據(jù)ICH指導(dǎo)原則的相關(guān)規(guī)定，對應(yīng)查找雜質(zhì)限度。值得說明的是，即使按照ICH指導(dǎo)原則來看，對應(yīng)報(bào)告限度為0.05%，它只是針對檢驗(yàn)這個(gè)產(chǎn)品是否合格、是否可放行時(shí)的報(bào)告限度，在研究階段不建議將0.05%以下的小雜質(zhì)忽略不計(jì)。

若真的忽略掉，很可能會(huì)忽略掉一些降解趨勢或是產(chǎn)品的其他特性。

另外還要仔細(xì)對比和研究各已有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的雜質(zhì)限度，以目前審評趨勢來看，各雜質(zhì)限度推薦以最嚴(yán)格的限度來控制。

針對工藝雜質(zhì)，放行標(biāo)準(zhǔn)和貨架期標(biāo)準(zhǔn)一般來說是一致的。針對有明顯降解趨勢的降解雜質(zhì)，可以將放行標(biāo)準(zhǔn)收嚴(yán)，以確保在穩(wěn)定性過程中產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)合格。

 

分析方法的確定

 

確定雜質(zhì)的研究思路之后，可以開始技術(shù)性地進(jìn)行方法開發(fā)。

 

1.已有標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)的參考與匯總

于仿制藥而言，對已有標(biāo)準(zhǔn)的研究和分析是很重要的環(huán)節(jié)。在開發(fā)方法之前，應(yīng)將已有標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)全面匯總分析，推薦列表如下：

 

 

模塊	自擬標(biāo)準(zhǔn)	進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)	USP	BP/EP	..
色譜柱
流動(dòng)相
梯度洗脫程序
柱溫
波長
流速
稀釋溶劑
系統(tǒng)適用性
進(jìn)樣體積
供試品濃度
對照品/對照溶液
計(jì)算方法
限度要求

 

2.色譜條件的選擇

首先，這個(gè)部分的研究，應(yīng)基于對各已有標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)方法的了解。如果各標(biāo)準(zhǔn)中色譜條件完全不同，可分別進(jìn)行重現(xiàn)。重現(xiàn)過程中主要關(guān)注：各雜質(zhì)組分峰的分離情況、供試品檢出雜質(zhì)的靈敏度情況、峰型和基線的美觀度、方法的省時(shí)省力程度，從中選擇最優(yōu)方法進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。

 

但，有一點(diǎn)要注意的是，在重現(xiàn)已有標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)候，一定要多想一想，這個(gè)色譜條件是不是已經(jīng)研究透徹了，是不是真的做到了重現(xiàn)。比如有些進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)，色譜柱的品牌和類型并未詳細(xì)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)者隨意拿來一根色譜柱使用，峰型不好就將這個(gè)方法摒棄了，這是很武斷的，一定要仔細(xì)對各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行考察，也許不小心放掉的就是方法開發(fā)中的關(guān)鍵點(diǎn)。

 

有時(shí)候作為舶來品的國外標(biāo)準(zhǔn)或進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)是會(huì)放些煙霧彈來迷惑當(dāng)事人的，但是改變它的一些關(guān)鍵參數(shù)也會(huì)帶來風(fēng)險(xiǎn)。比如無故提高供試品濃度，可能會(huì)帶來峰型美觀度的下降，雜質(zhì)的檢出過于靈敏，組分峰間分離度減小，而且這些風(fēng)險(xiǎn)和弊端可能會(huì)在日積月累的檢驗(yàn)過程中日益凸顯，后續(xù)再去修改和調(diào)整方法，又會(huì)浪費(fèi)人力物力，得不償失。因此，在調(diào)整方法時(shí)要考慮，是不是各方面都已考察完全，避免給自己后續(xù)帶來不必要的麻煩。

 

在色譜條件優(yōu)化時(shí)，應(yīng)充分考慮雜質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。比如：極性、酸堿性、溶解度、特征基團(tuán)，這些特點(diǎn)會(huì)在調(diào)整色譜條件時(shí)給實(shí)驗(yàn)者很多啟示。對色譜條件進(jìn)行重現(xiàn)和優(yōu)化之后，有關(guān)物質(zhì)的分析方法就可初步擬定了。

 

3.檢測波長的確認(rèn)

選擇檢測波長，可使用PDA檢測器的液相色譜儀，在進(jìn)行方法確認(rèn)時(shí)，直接提取各雜質(zhì)定位溶液的紫外吸收光譜而定，當(dāng)然也可以用紫外光譜儀分別掃描各組分對照品溶液（個(gè)人覺得比較麻煩，不推薦）。各雜質(zhì)在所選波長處均應(yīng)有較大吸收（有時(shí)綜合考慮已有標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的檢測波長）。

 

4.溶液的配制方式

旨在考察提取的方法、次數(shù)、時(shí)間等因素。

當(dāng)供試品穩(wěn)定性不好或者主成分難以從制劑中提取出來時(shí)，應(yīng)考察超聲、振搖或其他方式，以及處理的時(shí)間長短。主成分提取的難易程度取決于主成分在溶劑中的溶解性和制劑工藝，應(yīng)視情況而選擇應(yīng)有的方式。若配制原料藥供試品溶液，一般僅考慮溶解性即可。

 

推薦每種方式平行考察2~3份樣品，評估每種配制方式的雜質(zhì)個(gè)數(shù)、單個(gè)雜質(zhì)含量、雜質(zhì)總量、主成分含量等，確保選定的配制方式可以將供試品提取完全，且提取過程中未發(fā)生明顯降解。

提醒：最終選定的配制方式應(yīng)有一定的耐用性，比如提取時(shí)間有小的變動(dòng)或者換用超聲儀、換用搖擺振蕩器時(shí)不會(huì)影響樣品的提取程度。還有一些情況下，在片劑或顆粒劑研細(xì)過程中，研缽也會(huì)吸附主成分，或是產(chǎn)生一些雜質(zhì)，也許換用投片法可以規(guī)避這些問題。

 

5.溶液的處理方式

主要針對于制劑的供試品溶液，配制后進(jìn)行離心/過濾處理。

推薦考察如下指標(biāo)：

溶液類型	推薦考察處理方式	考察指標(biāo)
空白溶劑	離心轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間、濾膜品牌、濾膜種類、不同濾膜批號等	離心與過濾后是否產(chǎn)生新的色譜峰，若產(chǎn)生，是否干擾各雜質(zhì)和主成分峰
空白輔料溶液		同“空白溶劑”
雜質(zhì)混合溶液		離心與過濾前后各雜質(zhì)峰面積的變化情況
供試品溶液		離心與過濾后雜質(zhì)個(gè)數(shù)、單個(gè)雜質(zhì)含量、雜質(zhì)總量、主成分峰面積等變化情況

 

同時(shí)也要考慮具體操作的可行性。比如一些制劑的緩釋材料會(huì)使過濾這個(gè)操作變得尤為困難，過濾一個(gè)供試品會(huì)讓一個(gè)小姑娘累到懷疑人生，此時(shí)在離心不受影響的前提下，只能推薦采用離心方式進(jìn)行處理。

 

6.總結(jié)和提示

上文寫出的是一些比較常見的開發(fā)過程，當(dāng)然每個(gè)品種有自己的特點(diǎn)，開發(fā)過程中要研究的可能會(huì)更多。比如有時(shí)在不同溶劑中，樣品的穩(wěn)定性會(huì)有所不同，那么溶劑的種類也要進(jìn)行考察和選擇。比如稱樣量和稀釋體積是否也會(huì)對供試品產(chǎn)生影響。各位需全面關(guān)注分析方法的各項(xiàng)參數(shù)，甚至觀察配制過程中的每一個(gè)現(xiàn)象，為方法開發(fā)的準(zhǔn)確可靠性再添一把柴。畢竟人生已經(jīng)夠艱難了，能少挖給自己的坑，就少挖一點(diǎn)吧。

 

方法學(xué)預(yù)驗(yàn)證

 

把預(yù)驗(yàn)證這部分放在方法開發(fā)中作為一個(gè)標(biāo)題來撰寫，是想要提示各位，不要開發(fā)出一個(gè)方法后，就匆忙開展方法學(xué)驗(yàn)證，先進(jìn)行一些預(yù)驗(yàn)證的試驗(yàn)也是非常有必要的。

1、強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)可以幫助補(bǔ)充理論中沒有被分析出來的降解雜質(zhì)，避免后續(xù)穩(wěn)定性過程中再產(chǎn)生，還要再重復(fù)研究一遍。

2、有些雜質(zhì)，配制和處理方式會(huì)影響其回收率結(jié)果。

3、對于一些結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的物質(zhì)，先期考察室溫和冷藏放置的溶液穩(wěn)定性，可避免驗(yàn)證過程中走不必要的彎路。

4、至于耐用性的預(yù)驗(yàn)證，更是不可忽視。