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本文適用范圍：主要針對(duì)采用高效液相色譜法進(jìn)行含量含均的檢查，氣相色譜法和紫外-可見分光光譜法由于儀器不同，對(duì)結(jié)果的要求會(huì)有差異，試驗(yàn)內(nèi)容基本相同。本文不適用容量法（滴定法）等其他方法。

 

一、含量方法學(xué)驗(yàn)證前的準(zhǔn)備工作

 

1.開發(fā)準(zhǔn)備

確保方法開發(fā)內(nèi)容各項(xiàng)足夠全面。即使方法學(xué)驗(yàn)證方案在時(shí)間上區(qū)分出了開發(fā)階段和驗(yàn)證階段，但在思路上，二者不該有明顯的界限。一個(gè)新品種的分析方法，理應(yīng)足夠準(zhǔn)確、靈敏和耐用，可以經(jīng)過時(shí)間和無數(shù)批商業(yè)化批次樣品的考驗(yàn)。開發(fā)與驗(yàn)證的全面性和靈活性缺一不可，分析工作或許會(huì)貫穿品種的整個(gè)生命周期。

 

2.物質(zhì)準(zhǔn)備

確定好方法學(xué)驗(yàn)證用樣品，準(zhǔn)備相關(guān)試劑、對(duì)照品、色譜柱等消耗品，確認(rèn)所使用儀器都在校驗(yàn)有效期內(nèi)，最后定稿方法學(xué)驗(yàn)證方案。——千百年來，兵馬與糧草的關(guān)系，你們都懂的。

 

3.心理準(zhǔn)備

準(zhǔn)備好強(qiáng)大的內(nèi)心，應(yīng)對(duì)突如其來的偏差、真假難辨的誤差、以及千奇百怪的各種問題。對(duì)業(yè)內(nèi)人士來說，排名第一的內(nèi)心獨(dú)白是要淡定，排名第二的內(nèi)心獨(dú)白還是要淡定。

 

二、含量方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容

 

廢話不說，先上一個(gè)匯總款的超級(jí)無敵大表格，如下：

 

注：該表格為常規(guī)實(shí)驗(yàn)概述，特殊情況請(qǐng)自行增減內(nèi)容。

 

下面分模塊講解各項(xiàng)試驗(yàn)內(nèi)容：

 

1.專屬性

1.1分離度考察試驗(yàn)

目的：考察空白溶劑、空白輔料和各雜質(zhì)與待測(cè)組分峰之間的分離情況。

空白溶劑、對(duì)照品溶液、供試品溶液：按擬定標(biāo)準(zhǔn)配制。

空白輔料溶液：空白輔料按處方比例混合后，按擬定標(biāo)準(zhǔn)配制。

各已知雜質(zhì)定位溶液：沒有明確規(guī)定，在配制濃度下雜質(zhì)峰可見即可。勿配太大或太小，太大峰型過寬，不利于定位保留時(shí)間；太小在量程下看不到雜質(zhì)峰，無法歸屬。

有時(shí)可配制雜質(zhì)混合溶液，用來排除雜質(zhì)干擾。再配制加入主成分（主成分待測(cè)濃度）和各雜質(zhì)的混合溶液，確定主成分與相鄰雜質(zhì)的分離度——兩針搞定，無需進(jìn)針分析各雜質(zhì)定位溶液。

 

1.2強(qiáng)制降解試驗(yàn)

目的：考察降解生成的雜質(zhì)與主成分峰之間的分離情況，同時(shí)可以大致了解樣品在各降解條件下的穩(wěn)定性情況。

對(duì)于含量測(cè)定的強(qiáng)制降解試驗(yàn)，我們一般不需要知道降解所產(chǎn)生的雜質(zhì)究竟是誰(shuí)，只要確定降解雜質(zhì)不影響主成分的測(cè)定即可。

同樣的，主峰峰純度也是要關(guān)注的?？粗鞣逯惺欠癜渌M分峰。

降解試驗(yàn)條件要適度，降解程度盡量不低于80%，若條件足夠劇烈，供試品仍未降解產(chǎn)生雜質(zhì)，無需再提高降解條件的劇烈程度進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

注意：若分析方法為等度洗脫，降解試驗(yàn)的采集時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)，避免降解產(chǎn)生的雜質(zhì)未洗脫出來而影響下一針分析。

 

2.溶液穩(wěn)定性

目的：考察對(duì)照品溶液和供試品溶液配制后的穩(wěn)定時(shí)間，為工藝驗(yàn)證、批檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察以及上市后的含量測(cè)定提供依據(jù)。

系統(tǒng)適用性溶液視情況考察，對(duì)照品溶液與供試品溶液必須考察。

應(yīng)先考察室溫下的溶液穩(wěn)定性，若不穩(wěn)定，則應(yīng)逐一排除，找出不穩(wěn)定的原因（光、熱、析出等原因），然后再重復(fù)考察避光條件或冷藏條件下是否穩(wěn)定。若仍然不穩(wěn)定，可考慮更換溶劑、更換流動(dòng)相系統(tǒng)等方法。如無法解決樣品不穩(wěn)定的問題，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需規(guī)定供試品臨用現(xiàn)配。

注意：溶液穩(wěn)定性的考察時(shí)間也應(yīng)針對(duì)具體情況，如采集時(shí)間較長(zhǎng)，考察時(shí)間也應(yīng)延長(zhǎng)，目的是使后續(xù)檢驗(yàn)更方便。

 

3.定量限

目的：為確保分析方法測(cè)定供試品含量的靈敏度。

定量限的概念：是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測(cè)能力。

將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，當(dāng)稀釋至信噪比約為10時(shí)，此時(shí)濃度可作為定量限濃度。

含量測(cè)定并不強(qiáng)制要求做檢測(cè)限。

注意：定量限結(jié)果受色譜系統(tǒng)影響較大，如色譜柱、流動(dòng)相、色譜儀的狀態(tài)，甚至次日試驗(yàn)的結(jié)果會(huì)與前一天不同，在這種情況下，若定量限濃度較低，應(yīng)換用色譜系統(tǒng)再次測(cè)定，以確保方法的靈敏度。

 

4.線性與范圍

目的：在規(guī)定的濃度范圍內(nèi)，測(cè)定響應(yīng)值（峰面積）與待測(cè)組分濃度呈比例關(guān)系的程度。

敲黑板——峰面積與濃度呈線性關(guān)系，是外標(biāo)法的前提。

配制一份對(duì)照品母液，從中稀釋配制成一系列不同濃度的線性溶液，至少制備5份（建議濃度點(diǎn)的總數(shù)為奇數(shù)），以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)對(duì)待測(cè)物的濃度作圖，檢查是否呈良好的線性關(guān)系。

含量測(cè)定線性范圍應(yīng)至少為80%~120%或更寬，含量均勻度線性范圍應(yīng)至少為70%~130%或更寬，線性的濃度范圍理應(yīng)涵蓋回收率考察的濃度范圍，但注意濃度最低點(diǎn)應(yīng)高于定量限濃度。

附一張推薦的數(shù)據(jù)結(jié)果表格與線性關(guān)系圖如下：

 

  

 

5.精密度

 

5.1儀器精密度

目的：為保證儀器每次所測(cè)對(duì)照品溶液峰面積均一致，以確保含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)儀器精密度試驗(yàn)。

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次?？疾毂Ａ魰r(shí)間和峰面積的RSD%。

 

5.2重復(fù)性

目的：考察六次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。

按照擬定標(biāo)準(zhǔn)配制空白溶劑、對(duì)照品溶液和6份供試品溶液（系統(tǒng)適用性溶液視情況配制），計(jì)算6份供試品溶液的含量，計(jì)算平均值并統(tǒng)計(jì)6份結(jié)果的RSD值。

2015年版中國(guó)藥典關(guān)于重復(fù)性的可接受范圍截圖如下：

     

5.3中間精密度

目的：考察在同一實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間，由不同人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的接近程度。

溶液配制與實(shí)驗(yàn)要求同重復(fù)性。

 

6.準(zhǔn)確度

 

目的：考察采用擬定方法測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，也叫做回收率試驗(yàn)。用至少測(cè)定6份結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，或設(shè)計(jì)3種不同濃度，每個(gè)濃度平行配制3份。

按照擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配制空白溶劑、對(duì)照品溶液。

回收率供試品溶液：按處方比例混合的空白輔料+主成分對(duì)照品，再按照擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配制溶液。

僅做含量測(cè)定，推薦濃度為80%、100%、120%。

做含量均勻度，推薦濃度為70%、100%、130%。

2015年版中國(guó)藥典關(guān)于回收率的可接受范圍截圖如下：

 

7.耐用性

 

目的：考察色譜條件發(fā)生微小變化時(shí)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。

按照擬定標(biāo)準(zhǔn)配制空白溶劑、對(duì)照品溶液和供試品溶液（系統(tǒng)適用性溶液視情況配制），計(jì)算不同條件下供試品的含量測(cè)定結(jié)果，關(guān)注系統(tǒng)適用性是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求（有時(shí)含量測(cè)定的方法中并不擬定配制系統(tǒng)適用性溶液，而是規(guī)定主峰理論板數(shù)和拖尾因子等，也要相應(yīng)關(guān)注和統(tǒng)計(jì)。）。

同樣放一張表格，將耐用性試驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果要求直觀呈現(xiàn)如下：

耐用性考察的內(nèi)容可能還有很多，請(qǐng)各位根據(jù)實(shí)際情況增減。另外，有時(shí)幾個(gè)條件同時(shí)變化的情況下是否耐用，也是需要考察的。但考察疊加條件工作量較大，可自行選擇較為重要的條件進(jìn)行考察。耐用性試驗(yàn)時(shí)，觀察峰型和結(jié)果的變化趨勢(shì)，后續(xù)檢驗(yàn)一旦出現(xiàn)問題，可以通過現(xiàn)象推測(cè)偏差原因，及時(shí)解決問題。

 

注意：變化不同色譜條件時(shí)，切記根據(jù)需要延長(zhǎng)采集時(shí)間。

 

做完以上這些內(nèi)容，各項(xiàng)結(jié)果均合格，就可以皆大歡喜去轉(zhuǎn)移方法了。如果哪一項(xiàng)出現(xiàn)問題，建議先進(jìn)行復(fù)測(cè)（必要時(shí)，換人換儀器進(jìn)行復(fù)測(cè)），先找出問題所在，再行調(diào)整方法。

 

三、總結(jié)和提示

 

1.目前藥品研發(fā)企業(yè)對(duì)時(shí)間的觀念可謂超強(qiáng)，申報(bào)時(shí)間延誤不得，在這種大環(huán)境下，合理安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間至關(guān)重要。每天實(shí)驗(yàn)之前多想想，是否有多個(gè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照品溶液是可共用的，是否有多個(gè)實(shí)驗(yàn)是可以同時(shí)開展進(jìn)行的。統(tǒng)籌規(guī)劃，可以為你節(jié)省很多時(shí)間和精力，以及，買對(duì)照品的錢。

 

2.有時(shí)容易被忽略掉的，是中間產(chǎn)品的含量測(cè)定方法。我們通常習(xí)慣于直接采用成品的含量測(cè)定方法進(jìn)行中間產(chǎn)品的控制，然而總混顆粒跟片劑的性質(zhì)仍然有差異，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)方法并不適用的情況，比如中間產(chǎn)品重復(fù)性不好，比如研磨時(shí)出現(xiàn)吸附現(xiàn)象，比如有時(shí)成品含量測(cè)定稱樣量較大而中間產(chǎn)品則可相應(yīng)減小稱樣量。在方法驗(yàn)證前期注意到這些細(xì)節(jié)，及時(shí)進(jìn)行考察，避免測(cè)定時(shí)才發(fā)現(xiàn)問題，會(huì)更加被動(dòng)。