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嘉峪檢測網(wǎng) 2021-06-16 09:40
本文主要針對高效液相色譜法測定有關(guān)物質(zhì)的方法學(xué)驗證。任何技術(shù)貼都不可避免存在不足和爭議，我們也在行進(jìn)中不斷進(jìn)步和糾偏，未盡之處歡迎討論與溝通。
一、方法學(xué)驗證匯總表
先來一個張表格，送給各位讀者，這個表格既是有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)驗證試驗中的標(biāo)桿和尺度，也作為申報資料中的一部分。現(xiàn)將梗概羅列匯總?cè)缦?，坐好別搶，見者有份：
二、方法學(xué)驗證內(nèi)容
這個版塊海棠君將匯總表格中各項試驗?zāi)K具體步驟和注意事項掰開詳述。有且不僅有這些內(nèi)容，研發(fā)品種千差萬別，請根據(jù)自身情況做相應(yīng)調(diào)整。
1.專屬性試驗
有關(guān)物質(zhì)的專屬性指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料組分等）可能存在的情況下，采用的分析方法能夠準(zhǔn)確測定出待測雜質(zhì)的特性，應(yīng)包括雜質(zhì)分離度考察試驗和強制降解試驗兩部分。
專屬性是方法學(xué)驗證的前提。若方法不專屬，后續(xù)一切驗證都是徒勞。
1.1雜質(zhì)分離度考察
空白溶劑：按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定配制。
空白輔料溶液：按處方比例配制并混勻，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中供試品的配制方法配制。
各定位溶液：應(yīng)包括所有研究的雜質(zhì)和主成分。各定位溶液的濃度應(yīng)適宜，太小則不易辨認(rèn)，太大則峰太寬不易定位保留時間。
供試品溶液：按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定配制。
混合溶液：其中組分包括主成分（測定濃度）和各已知雜質(zhì)（不得小于限度濃度）。
空白溶劑和空白輔料若有色譜峰，則應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中寫明扣除。
1.2強制降解試驗
強制降解試驗旨在考察色譜條件對降解產(chǎn)物與各已知組分之間的分離能力、樣品可能存在的降解途徑，也可大概推測樣品的穩(wěn)定性情況（由于強制降解試驗條件過于劇烈，穩(wěn)定性情況未必準(zhǔn)確）。
破壞條件一般包括：酸、堿、氧化、高溫、光照，有時也根據(jù)需要進(jìn)行高濕或者高溫高濕的條件考察。采用上述條件降解樣品，研究可能存在的降解產(chǎn)物和降解途徑對雜質(zhì)測定的影響，并對主成分峰進(jìn)行峰純度檢查。
配制樣品：原料藥、輔料、自制品、市售品。有關(guān)物質(zhì)的強制降解試驗要考察降解雜質(zhì)的來源，不應(yīng)忽略空白輔料的配制。每個序列中推薦分析含有各已知雜質(zhì)的混合溶液，作為供試品溶液所檢出雜質(zhì)的歸屬依據(jù)。
注意事項：
a.降解條件要適度，以主成分峰面積降解至80%~90%為宜。
b.為避免有小極性的物質(zhì)降解產(chǎn)生，沒有被充分洗脫出來，應(yīng)視情況將采集時間延長。
c.計算質(zhì)量守恒指數(shù)時，應(yīng)考慮到雜質(zhì)的校正因子。
d.將溶液放置于高溫條件下的時候，應(yīng)置于水浴鍋中，而不是放在烘箱中。
e.為避免溶劑峰過大而影響雜質(zhì)檢出，酸、堿、和氧化所用試劑使用量在可浸潤樣品的情況下盡量少。
試驗結(jié)果給出后，我們應(yīng)思考和注意這些問題：
a.當(dāng)原料藥、自制品、市售品的降解趨勢不同時，應(yīng)分析并說明原因。
b.若有較大未知雜質(zhì)降解產(chǎn)生，應(yīng)對其進(jìn)行界定，并分析是否應(yīng)對該雜質(zhì)進(jìn)行研究。
c.與含量測定方法學(xué)驗證中的降解試驗結(jié)果進(jìn)行對比，分析降解程度是否具備合理性。
e.強制降解試驗的結(jié)果也許不能被準(zhǔn)確重復(fù)出來，這是正常的，但應(yīng)控制試驗條件和試驗環(huán)境，盡量避免試驗結(jié)果的偶然性。
2.定量限與檢測限
定義：
定量限系指待測組分能夠被準(zhǔn)確定量測定的最低量。
檢測限系指待測組分能夠被可靠地檢測出來的最低量。
二者能夠體現(xiàn)出色譜系統(tǒng)檢測有關(guān)物質(zhì)的靈敏度情況。
一般用信噪比作為參數(shù)來呈現(xiàn)靈敏度。信噪比即把已知低濃度試樣測出的信號與噪聲信號進(jìn)行比較，用S/N表示。一般情況下，將信噪比約為3:1時相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限，將信噪比約為10:1時相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。
配制溶液時，可先配制限度濃度的混合溶液，得出各組分的信噪比，再根據(jù)信噪比逐級稀釋至S/N=10或3。有時為方便操作，也可使用線性溶液進(jìn)行逐級稀釋。
可以混合進(jìn)樣，也可以單個或部分混合進(jìn)樣。沒有硬性要求。
注意：為確保檢測方法的靈敏度，推薦考察不同儀器和試驗條件下的定量限與檢測限情況。
3.溶液穩(wěn)定性
旨在考察對照品溶液/自身對照溶液、供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液在一定檢測時間內(nèi)的穩(wěn)定性情況。
對照品溶液/自身對照溶液以峰面積變化為指標(biāo)考察穩(wěn)定性。
供試品溶液以雜質(zhì)檢出個數(shù)、單個雜質(zhì)含量、雜質(zhì)總量的變化為指標(biāo)考察溶液穩(wěn)定性。
系統(tǒng)適用性溶液按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定需符合要求，并不應(yīng)有較大降解峰產(chǎn)生。當(dāng)配制系統(tǒng)適用性溶液所需已知雜質(zhì)對照品不易獲得時，也推薦考察放置較長時間的穩(wěn)定性，以便配制后保存留用，無需每次試驗配制系統(tǒng)適用性溶液。
對試驗結(jié)果的思考：
a.若樣品對熱不穩(wěn)定，可考察樣品盤冷藏控溫放置，冷藏過程中注意觀察樣品在低溫下是否有析出現(xiàn)象。
b.若樣品對光照不穩(wěn)定，可考察避光放置或棕色瓶放置。
c.根據(jù)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性，有時換用溶劑可以改善溶液穩(wěn)定性。
d.溶液穩(wěn)定性結(jié)果是今后樣品檢驗時間的依據(jù)，不穩(wěn)定的樣品應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中寫明臨用現(xiàn)配。
4.線性與范圍
旨在驗證在各雜質(zhì)的測定范圍內(nèi)，待測組分響應(yīng)值與濃度的線性關(guān)系。
制備一個高濃度的對照品貯備液，逐步稀釋一系列不同濃度的對照品溶液。各雜質(zhì)濃度推薦范圍為定量限~限度濃度的200%，分別進(jìn)樣分析。以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制線形圖，報告回歸方程和相關(guān)系數(shù)。
注意：
a.各雜質(zhì)限度濃度的20%應(yīng)至少大于定量限濃度。
b.線性溶液稀釋時，應(yīng)考慮移取體積的合理性。
c.制備至少5個以上濃度點，盡量均勻分布。
5.校正因子
采用主成分對照品和雜質(zhì)對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值進(jìn)行比較獲得。
當(dāng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了雜質(zhì)的校正因子時，應(yīng)對校正因子進(jìn)行全面的驗證，確保數(shù)值準(zhǔn)確。
包括準(zhǔn)確度（用加校正因子方法計算回收率）、精密度（采用不同儀器、由不同人員考察）、耐用性（當(dāng)色譜條件發(fā)生微小變化時，校正因子不應(yīng)變化）等驗證內(nèi)容。
校正因子在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定：當(dāng)校正因子在0.9~1.1時，可不予校正；0.2~5.0時，可采用加校正因子的計算方法；超出0.2~5.0范圍時，不能采用加校正因子的方法計算。
6.精密度
6.1儀器精密度
目的：為保證儀器每次所測對照品溶液/自身對照溶液峰面積均一致，以確保有關(guān)物質(zhì)結(jié)果的準(zhǔn)確性，設(shè)計儀器精密度試驗。
取對照品溶液/自身對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次?？疾毂Ａ魰r間和峰面積的RSD%。
6.2重復(fù)性
目的：在相同條件下，由同一個分析人員測定結(jié)果的精密度。
1.按照擬定標(biāo)準(zhǔn)配制空白溶劑、對照品溶液/自身對照溶液和6份供試品溶液，計算6份供試品溶液的含量，計算平均值并統(tǒng)計6份結(jié)果的RSD值。
2.可用加標(biāo)法進(jìn)行考察，具體可參考準(zhǔn)確度試驗項下。
2015年版中國藥典關(guān)于重復(fù)性的可接受范圍截圖如下：
6.3中間精密度
目的：考察在同一實驗室，不同時間，由不同人員用不同設(shè)備測定結(jié)果之間的接近程度。
溶液配制與實驗要求同重復(fù)性。
6.4重現(xiàn)性
目的：考察在不同實驗室，由不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度。
溶液配制與實驗要求同重復(fù)性。
7.準(zhǔn)確度
準(zhǔn)確度系指分析方法的測定結(jié)果與真實值之間的接近程度，一般用回收率（%）表示。有關(guān)物質(zhì)的準(zhǔn)確度試驗一般采用加標(biāo)法，即：向原料藥或制劑的供試品中加入已知量的雜質(zhì)對照品進(jìn)行測定。用至少測定6份結(jié)果進(jìn)行評價，或設(shè)計3種不同濃度，每個濃度平行配制3份。計算時需扣除本底供試品的雜質(zhì)含量。
2015年版中國藥典關(guān)于回收率的可接受范圍截圖如下：
推薦結(jié)果整理表格如下：
注意事項：
a.在研究過程中雜質(zhì)限度可能會有所變化（收緊或放寬），回收率的濃度設(shè)計可多個不同濃度，以便涵蓋變動后雜質(zhì)測定濃度范圍。
b.試驗中每一個供試品溶液的回收率均應(yīng)滿足回收率限度，而不是只看回收率均值。
c.有時回收率不合格，并不是因為無法回收，而是因為雜質(zhì)峰型不好導(dǎo)致數(shù)據(jù)結(jié)果不佳，此時應(yīng)合理積分或?qū)ιV條件進(jìn)行微調(diào)，嘗試改善峰型。
8.耐用性
目的：考察色譜條件發(fā)生微小變化時對有關(guān)物質(zhì)結(jié)果的影響。
按照擬定標(biāo)準(zhǔn)配制空白溶劑、對照品溶液/自身對照溶液和供試品溶液，計算不同條件下供試品的有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果，并關(guān)注系統(tǒng)適用性是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求。
同樣放一張表格，將耐用性試驗內(nèi)容和結(jié)果要求直觀呈現(xiàn)如下：
若耐用性試驗中發(fā)現(xiàn)分析方法對某個條件要求苛刻，應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中予以體現(xiàn)，并注明可接受變動的范圍。
9.其他
這個模塊簡單來說，就是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定什么，就去驗證什么。
舉例來說：規(guī)定了雜質(zhì)的相對保留時間，就去探討和驗證相對保留時間的準(zhǔn)確性和耐用性；規(guī)定了幾分鐘內(nèi)的色譜峰作為空白輔料峰扣除，就去驗證所扣除的時間段是否嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確。
三、總結(jié)和思考
每個有關(guān)物質(zhì)的分析方法都有各自的特點，應(yīng)對具體情況作具體分析。方法學(xué)驗證是為了形成更科學(xué)和全面的分析方法，作為研究者，不能千篇一律，為了驗證而做驗證。遵循和嚴(yán)守是質(zhì)量人員的職責(zé)，而開發(fā)與完善是研發(fā)人員的職責(zé)。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)問題、解決問題，并在每一次周旋與教訓(xùn)之后獲得新的思考，這就是研發(fā)者在職業(yè)生涯中最珍貴的，經(jīng)驗。
來源：銘研醫(yī)藥
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