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前言  作為一名質(zhì)量分析人員，在分析方法開(kāi)發(fā)、轉(zhuǎn)移或確認(rèn)中，難免會(huì)遇到一些問(wèn)題如色譜峰分叉、分析方法不能重現(xiàn)等，而導(dǎo)致這些問(wèn)題的原因如溶劑效應(yīng)、緩沖鹽選擇不恰當(dāng)、色譜柱不合適等。筆者分享一個(gè)具體的案例。

最近，筆者在檢測(cè)某藥物（復(fù)合物堿（M）+酸（N））中的殘留溶劑（三氟乙酸）時(shí)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)進(jìn)三氟乙酸對(duì)照品是一個(gè)峰，進(jìn)系統(tǒng)適用性溶液（三氟乙酸+樣品）時(shí)發(fā)現(xiàn)三氟乙酸的色譜峰分叉，考慮是樣品原因引起的（主成分的色譜峰已經(jīng)是平頂峰）。

其實(shí)驗(yàn)條件如下：流動(dòng)相（A）0.07%磷酸（PH3.0），流動(dòng)相（B）甲醇；洗脫梯度：0-6min，100%A；6.01-20min，90%-50%A；20.01-30min，100%A；色譜柱：Ultimate AQ-C18；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20µl；三氟乙酸儲(chǔ)備液為1.5mg/ml，三氟乙酸對(duì)照溶液0.15mg/ml；系統(tǒng)適用性溶液：供試品0.2g，先用純化水溶解，再加三氟乙酸儲(chǔ)備液，然后定容至20ml。

1、調(diào)查不同樣品量對(duì)三氟乙酸色譜峰的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：分別取樣品約0.02g、0.05g、0.1g、0.2g置于20ml容量瓶中，加適量純化水溶解，各加三氟乙酸儲(chǔ)備液2ml，然后分別定容至刻度，進(jìn)樣分析（色譜條件同上），結(jié)果如下圖。

從圖1中可以看出，當(dāng)加入樣品的量為0.1g時(shí)，三氟乙酸色譜峰的峰形已經(jīng)略有變化（峰變寬且略有拖尾）；當(dāng)加入樣品的量為0.2g時(shí)，三氟乙酸的色譜峰分叉。

一般來(lái)說(shuō)，只要樣品樣品中各個(gè)成分的重量不要過(guò)多（通常對(duì)于4.6mm內(nèi)徑的柱子進(jìn)樣量＜500µg），每個(gè)峰帶在柱子內(nèi)的移動(dòng)就不會(huì)受樣品中其它峰帶的影響。因此，樣品中單個(gè)化合物的重量，往往決定了化合物是否會(huì)超載，峰形是否改變，而與樣品總量無(wú)關(guān)。

當(dāng)加入樣品的量為0.1g時(shí)，，主成分的色譜峰為平頂峰，雖然色譜峰超載，但并沒(méi)有影響其它組份的分離；當(dāng)加入樣品的量為0.2g時(shí)，三氟乙酸色譜峰的分離受到影響。實(shí)質(zhì)上是樣品和稀釋溶劑組成三氟乙酸的稀釋劑，供試品與溶劑組成的溶液的PH與流動(dòng)相不同，也就是三氟乙酸在稀釋劑中的電離狀態(tài)與流動(dòng)相中的狀態(tài)不同，供試品濃度越大，影響越大。因此可以減少樣品量來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。

2、考察不同稀釋劑對(duì)三氟乙酸色譜峰的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：取樣品約0.2g置于20ml容量瓶中，分別加適量純化水、PH3.0流動(dòng)相、0.1%磷酸溶解，各加三氟乙酸儲(chǔ)備液2ml，然后分別定容至刻度，進(jìn)樣分析（色譜條件同上），結(jié)果如下圖。

從圖中可以看出，在加入樣品量為0.2g時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)稀釋劑對(duì)三氟乙酸色譜峰的峰形有所改善。

通常情況下，樣品溶劑比流動(dòng)相弱，進(jìn)樣體積不會(huì)對(duì)峰寬和分離度造成負(fù)面影響；相反，樣品溶劑比流動(dòng)相強(qiáng)時(shí)，往往會(huì)使色譜圖中較早流出的色譜峰扭曲變形或峰寬加寬。用流動(dòng)相作為稀釋劑，得到的峰形相對(duì)較好，是因?yàn)槿宜嵩谙♂寗┖土鲃?dòng)相中的電離狀態(tài)較為一致；0.1%磷酸作為稀釋劑，三氟乙酸部分質(zhì)子化，在稀釋劑中的狀態(tài)與流動(dòng)相中的狀態(tài)不一致。

3、考察不同流動(dòng)相PH對(duì)三氟乙酸色譜峰的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：流動(dòng)相（A）為0.07%磷酸，調(diào)節(jié)PH為6.0（三乙胺調(diào)節(jié)）；取樣品約0.2g置于20ml容量瓶中，加適量流動(dòng)相溶解，各加三氟乙酸儲(chǔ)備液2ml，然后分別定容至刻度，進(jìn)樣分析（色譜條件同上），結(jié)果如下圖。

從圖中可以看出，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相的PH可以明顯改善三氟乙酸色譜峰的峰形，主要原因是通過(guò)增加流動(dòng)相的PH減弱主成分對(duì)三氟乙酸的影響，增加了化合物與色譜柱之間的作用力，從而增強(qiáng)了色譜柱的篩選作用。其主要原因是流動(dòng)相中的三乙胺與色譜柱上的固定相作用，然后再與三氟乙酸作用，形成離子對(duì)作用，所以圖中三氟乙酸色譜峰保留時(shí)間增長(zhǎng)，但基線較差，是因?yàn)殡x子對(duì)效應(yīng)，平衡時(shí)間短。

4、將0.07%磷酸改為20mM磷酸二氫鉀（PH6.0）

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：流動(dòng)相（A）為20mM磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)PH為6.0（氨水調(diào)節(jié)）；取樣品約0.2g置于20ml容量瓶中，加適量流動(dòng)相溶解，各加三氟乙酸儲(chǔ)備液2ml，然后分別定容至刻度，進(jìn)樣分析（色譜條件同上），結(jié)果如下圖。

從圖中可以看出，將0.07%磷酸（PH6.0）改為20mM磷酸二氫鉀（PH6.0）后，三氟乙酸色譜峰仍然分叉（樣品與對(duì)照），主要原因是流動(dòng)相緩沖能力不足引起的。

5、將0.07%磷酸改為20mM磷酸二氫鉀（PH3.0）

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：流動(dòng)相（A）為20mM磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)PH為3.0（氨水調(diào)節(jié)）；取樣品約0.2g置于20ml容量瓶中，加適量流動(dòng)相溶解，各加三氟乙酸儲(chǔ)備液2ml，然后分別定容至刻度，進(jìn)樣分析（色譜條件同上），結(jié)果如下圖。

從圖中可以看出，將0.07%磷酸（PH6.0）改為20mM磷酸二氫鉀（PH3.0）后，三氟乙酸色譜峰仍然分叉（樣品與對(duì)照），主要原因是流動(dòng)相緩沖能力不足引起的。

綜上所述，流動(dòng)相的PH和稀釋劑可以顯著影響色譜峰的峰形，因此在平時(shí)實(shí)驗(yàn)中要注意稀釋劑效應(yīng)和流動(dòng)相的緩沖容量。

總結(jié) 

（1）在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，樣品始終具有溶劑效應(yīng)；

（2）調(diào)整流動(dòng)相的PH可以改變樣品進(jìn)樣量，并且影響色譜峰的峰形；

（3）使用流動(dòng)相作為稀釋劑可以改善色譜峰的峰形。