今日，國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布了醫(yī)械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《牙科學(xué) 牙科治療機(jī)用于水路生物膜處理的試驗(yàn)方法》征求意見稿，全文如下：
牙科學(xué) 牙科治療機(jī)用于水路生物膜處理的試驗(yàn)方法
(ISO 16954:2015, MOD)
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
本標(biāo)準(zhǔn)代替YY/T 1411—2016《牙科學(xué) 對(duì)改善或維持牙科治療機(jī)治療用水微生物質(zhì)量的措施進(jìn)行評(píng)估的試驗(yàn)方法》。
本標(biāo)準(zhǔn)修改采用ISO 16954:2015《牙科學(xué) 牙科治療機(jī)用于水路生物膜處理的試驗(yàn)方法》（英文版）。
本標(biāo)準(zhǔn)與YY/T 1411—2016相比主要變化如下：
--刪除了對(duì)生物膜的形成及特性的描述（見2016年版的5.2.2）；
--增加了試驗(yàn)用水的制備方法（見5.1,2016年版的8）；
—增加了“接種試驗(yàn)用水”（見5.3，2016年版的5.3.3）；
--增加了替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)重建的要素的規(guī)定（見6.1.1,2016年版的6.1）；
--增加了抗菌材料和防止微生物粘附的材料對(duì)評(píng)估試驗(yàn)方法的不同影響（見6.1.2）；
--增加了流速、流動(dòng)模式、試驗(yàn)環(huán)境溫度和時(shí)間的具體指標(biāo)，刪除了管理計(jì)劃表、計(jì)劃表和取樣計(jì)劃表（見6.2,2016年版的6.2）；
--增加了無(wú)菌試驗(yàn)用水在水路停留時(shí)間（見7.2.4,2016年版的5.3.4）；
--增加了微生物取樣和測(cè)試的定義（見7.3.2和7.3.4,2016年版的5.2.4）；
--增加了取樣的定義（見8.1.1,2016年版的9.1）；
—修改了活菌計(jì)數(shù)的方法（見8.1.2和8.1.3,2016年版的9.2）；
--修改了生物膜評(píng)估的方法（見8.2.2,2016年版的9.3）。
本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1對(duì)一些編排格式進(jìn)行了修改：
——刪除了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)前言；
——對(duì)于本文件中引用的其他國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，若已轉(zhuǎn)化為我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)，本文件將引用的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)號(hào)替換為相應(yīng)的國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)號(hào)，并在本文件第2章中注明采用關(guān)系。
請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)行機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。
本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)口腔材料和器械設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)齒科設(shè)備與器械分技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC99 SC1）歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：
牙科學(xué) 牙科治療機(jī)用于水路生物膜處理的試驗(yàn)方法
1 范圍
本文件提供了型式檢驗(yàn)的方法，主要用于評(píng)估在實(shí)驗(yàn)室條件下防止或抑制生物膜形成或去除存在于牙科治療機(jī)水路系統(tǒng)中的生物膜的處理方法的有效性。
本文件不適用于輸送無(wú)菌治療用水或無(wú)菌溶液的設(shè)備，也不適用于在牙科治療機(jī)內(nèi)輸送壓縮空氣的管線、管道或軟管。
本文件對(duì)相應(yīng)的微生物學(xué)指標(biāo)不做限度規(guī)定。所述方法不適用于臨床條件。本標(biāo)準(zhǔn)也未建立用于評(píng)估可能由治療方法引起的任何有害副作用的試驗(yàn)方法。
本文件提供的試驗(yàn)方法可用于測(cè)試其他向口腔輸送非無(wú)菌水的牙科設(shè)備。
2 規(guī)范性引用文件
以下文件全部或部分是本文件的規(guī)范性引用文件，對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
GB/T 6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法(ISO 3696:1995，MOD)
GB 9706.1-2020 醫(yī)用電氣設(shè)備 第1部分：基本安全和基本性能的通用要求(IEC 60601-1:2021,MOD)
GB/T 9937-2020牙科學(xué) 名詞術(shù)語(yǔ)(ISO 1942:2020,MOD)
GB/T 22592-2008水處理劑 pH值測(cè)定方法通則(ISO 10523:2008,NEQ)
YY/T 1043.1-2016牙科學(xué) 牙科治療機(jī) 第1部分：通用要求與測(cè)試方法(ISO 7494-1:2018,MOD)
YY/T 1043.2-2018牙科學(xué) 牙科治療機(jī) 第2部分：氣、水、吸引和廢水系統(tǒng)(ISO 7494-2:2015,IDT)
ISO 19458，水質(zhì)——微生物分析的抽樣（Water quality — Sampling for microbiological analysis）
3 術(shù)語(yǔ)與定義
除下列術(shù)語(yǔ)與定義外，GB 9706.1-2020、GB/T 9937-2020、YY/T 1043.1-2016和YY/T 1043.2-2018中所給出的術(shù)語(yǔ)與定義適用于本文件。
3.1 生物膜 biofilm
緊密黏附于物品表面的細(xì)菌團(tuán)塊與細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合體。
3.2 牙科治療機(jī) dental unit
由相互連接的牙科設(shè)備和器械構(gòu)成功能組合的用于牙科治療的設(shè)備。
[資料來(lái)源：GB/T 9937-2020, 2.86]
3.3 牙科治療機(jī)內(nèi)部供水系統(tǒng)dental unit procedural water delivery system
牙科治療機(jī)元件系統(tǒng)，用于將水從供水源輸送到用于牙科治療的一個(gè)或多個(gè)出口。
3.4 處理水 procedural water
由牙科治療機(jī)供給的，在口腔內(nèi)使用的水。
示例：手機(jī)冷卻水，噴槍用水，潔牙機(jī)冷卻水或漱口水。
[資料來(lái)源：YY/T 1043.2-2018, 3.1]
3.5 替代牙科治療機(jī)水處理系統(tǒng) surrogate dental unit water system
可準(zhǔn)確地重建牙科治療機(jī)內(nèi)部供水系統(tǒng)，包括治療用水系統(tǒng)中所有含水元件的設(shè)計(jì)、構(gòu)造、配置和操作，但不一定包括不直接接觸或控制治療用水流過(guò)牙科治療機(jī)元件的試驗(yàn)設(shè)備。
3.6 試驗(yàn)用水 test water
在添加指定的微生物挑戰(zhàn)菌懸液之前，用于試驗(yàn)的具有特定化學(xué)和物理特性的水。
3.7 微生物挑戰(zhàn)菌懸液bacterial challenge suspension
用于接種到試驗(yàn)用水的懸浮在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基或緩沖液中的特定菌懸液的混合物。
3.8 接種試驗(yàn)用水 inoculated test water
用于試驗(yàn)的制備好的水性菌懸液，其中包含指定量的無(wú)菌試驗(yàn)用水和一種或多種微生物挑戰(zhàn)菌懸液。
3.9 對(duì)照組的試驗(yàn)設(shè)備 test apparatus for the control group
不使用處理方法且在供水元件中不含抗菌材料的試驗(yàn)設(shè)備。
3.10 試驗(yàn)組的試驗(yàn)設(shè)備test apparatus for the test group
用于試驗(yàn)的設(shè)備，除非試驗(yàn)要求中另有規(guī)定，都應(yīng)使用牙科治療機(jī)制造商指定的處理方法以及制造商指定的供水元件中的任何抗菌材料。
4 處理方法
根據(jù)處理方法的具體技術(shù)方法及其預(yù)期結(jié)果，牙科治療機(jī)內(nèi)部供水系統(tǒng)處理方法的性能指標(biāo)可包括以下一項(xiàng)或兩項(xiàng)：
——對(duì)牙科治療機(jī)內(nèi)部供水系統(tǒng)表面生物膜形成的防止和抑制作用；
——對(duì)牙科治療機(jī)內(nèi)部供水系統(tǒng)表面生物膜的去除。
本標(biāo)準(zhǔn)為上述每個(gè)性能指標(biāo)規(guī)定了單獨(dú)的試驗(yàn)方法。這些要求可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)展，例如包括更多的重復(fù)試驗(yàn)或試驗(yàn)方案。對(duì)試驗(yàn)方法的補(bǔ)充應(yīng)遵循本標(biāo)準(zhǔn)的一般原則，并在試驗(yàn)報(bào)告中充分說(shuō)明。
5 試驗(yàn)用水和微生物挑戰(zhàn)菌懸液
5.1 試驗(yàn)用水
本條款規(guī)定了接種前試驗(yàn)用水的制備。
5.1.1 試劑
5.1.1.1 水，GB/T 6682-2008中的3級(jí)水。
5.1.1.2 氯化鈣（CaCl2）或等摩爾量的氯化鈣水合物。
5.1.1.3 氯化鎂（MgCl2）或等摩爾量的氯化鎂水合物。
5.1.1.4 碳酸氫鈉（NaHCO3）。
5.1.1.5 胰酶大豆培養(yǎng)基（TSB），1/3濃度，每升液體培養(yǎng)基含10.0g胰蛋白酶大豆培養(yǎng)基。
5.1.1.6 氫氧化鈉（NaOH），1 mol/l。
5.1.1.7 鹽酸（HCl）， 1 mol/l。
5.1.2 制備硬度儲(chǔ)備溶液1
將74.0g氯化鈣(5.1.1.2)和31.7g氯化鎂(5.1.1.3)溶于1.00l水(5.1.1.1)中。硬度儲(chǔ)備溶液1應(yīng)通過(guò)高溫滅菌或使用0.2μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，并在24小時(shí)內(nèi)使用或在(5 ± 3) °C下保存最多6個(gè)月。
5.1.3 制備硬度儲(chǔ)備溶液2
將56.0g碳酸氫鈉(5.1.1.4)溶于1.00l水(5.1.1.1)中。硬度儲(chǔ)備溶液2應(yīng)使用0.2μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，并在24小時(shí)內(nèi)使用或在(5 ± 3) °C下保存最多6個(gè)月。硬度儲(chǔ)備溶液2不進(jìn)行高溫滅菌。
5.1.4 接種前試驗(yàn)用水的制備
對(duì)于要制備的每升試驗(yàn)用水，將1.00ml的1/3濃度TSB（5.1.1.5）和1.80ml的硬度儲(chǔ)備溶液1（5.1.2）添加到1.00l的水中（5.1.1.1）并進(jìn)行蒸汽滅菌。滅菌溶液冷卻后，每升試驗(yàn)用水加入4.00ml用0.2μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌的硬度儲(chǔ)備溶液2。
通過(guò)添加氫氧化鈉（5.1.1.6）或鹽酸（5.1.1.7)，根據(jù)GB/T 22592-2008將測(cè)量的pH值調(diào)節(jié)至7.0至8.0。試驗(yàn)用水應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)使用或在（5±3）°C下保存不超過(guò)1周。
注1 制備的試驗(yàn)用水的硬度約為每升1.8mmol鈣離子（相當(dāng)于180 mg/l 的CaCO3）。這相當(dāng)于一般公認(rèn)的硬水范圍的上限[17]。
注2 試驗(yàn)用水的濃度約為每升10mg TSB，由此得出的總有機(jī)碳(TOC)含量約為4mg/l，但確切的TOC含量可能會(huì)有一些差異。這一近似的TOC水平與氯化飲用水中TOC的推薦上限4mg/l相一致[1]，并包含在試驗(yàn)用水中以減少生物膜形成的時(shí)間。
5.2 微生物挑戰(zhàn)
用于接種試驗(yàn)用水的微生物挑戰(zhàn)菌懸液必須使用美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)或國(guó)際授權(quán)的ATCC分銷商提供的下列細(xì)菌制備：
a) 銅綠假單胞菌(ATCC #700888)；
b) 肺炎克雷伯菌((ATCC #13882)。
如果沒(méi)有指定菌種，可以用銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌的替代菌種（即同一菌種的ATCC編號(hào)不同）代替，但ATCC所規(guī)定的分離源必須是水或供水系統(tǒng)。
菌種應(yīng)分別在無(wú)菌的稀釋TSB中復(fù)壯，濃度為每升0.3g TSB。復(fù)壯后的培養(yǎng)物應(yīng)在八個(gè)轉(zhuǎn)移通路內(nèi)使用。培養(yǎng)用于接種試驗(yàn)用水的細(xì)菌應(yīng)按照5.3的規(guī)定在接種試驗(yàn)用水前一天進(jìn)行。
在處理這些細(xì)菌時(shí)，包括處理可能被這些細(xì)菌污染的廢物時(shí)，遵守適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室安全操作規(guī)范至關(guān)重要。
5.3 接種試驗(yàn)用水
在試驗(yàn)設(shè)備運(yùn)行期間，應(yīng)在6.2.2中規(guī)定的日流量程序開始前兩小時(shí)內(nèi)，通過(guò)將兩種制備好的細(xì)菌培養(yǎng)物（5.2）接種到無(wú)菌試驗(yàn)用水（5.1）中來(lái)制備接種試驗(yàn)用水。以使接種試驗(yàn)用水中每種細(xì)菌的濃度達(dá)到5×101CFU/ml至5×102CFU/ml，細(xì)菌總濃度達(dá)到102CFU/ml至103CFU/ml。接種時(shí)無(wú)菌試驗(yàn)用水的溫度應(yīng)為（23±3）°C。
為了確保接種的試驗(yàn)用水中各菌種的準(zhǔn)確濃度，將每種制備好的細(xì)菌培養(yǎng)物離心并重懸在無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中，并使用比濁法確定大概的細(xì)菌濃度是有用的。利用這些結(jié)果，可以計(jì)算出要加入到試驗(yàn)用水中的每個(gè)單一菌種的菌懸液的體積?；蛘?，還可以使用其他方法來(lái)達(dá)到指定的接種范圍。
6 試驗(yàn)設(shè)備
試驗(yàn)設(shè)備應(yīng)包含指定數(shù)量的牙科治療機(jī)或與牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)基本一致的替代牙科治療機(jī)。
為獲得可重復(fù)的結(jié)果，每次進(jìn)行防止或抑制生物膜的試驗(yàn)方法(7.2)或防止或抑制生物膜的試驗(yàn)方法順序(7.2)和去除生物膜的試驗(yàn)方法(7.2)時(shí)，與治療用水接觸的試驗(yàn)設(shè)備的所有元件均應(yīng)為新元件。
注：按照7.3.1的規(guī)定，每次進(jìn)行防止或抑制生物膜的試驗(yàn)方法前（7.2），應(yīng)先在試驗(yàn)設(shè)備中顯影生物膜，再執(zhí)行去除生物膜的試驗(yàn)方法（7.3）。
6.1 試驗(yàn)設(shè)備的設(shè)計(jì)
6.1.1 概述
如果試驗(yàn)設(shè)備由牙科治療機(jī)組成，則牙科治療機(jī)應(yīng)是最不利的型號(hào)或配置（當(dāng)制造商可提供一種以上的型號(hào)或配置時(shí)）。在確定最具挑戰(zhàn)性的型號(hào)或配置時(shí)，應(yīng)考慮水路的長(zhǎng)度、分支水路的數(shù)量和停滯的可能性等因素。
如果試驗(yàn)設(shè)備由替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)組成，則替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)必須能夠模擬正常工作的牙科治療機(jī)的基本臨床性能參數(shù)，包括6.2中所述參數(shù)。替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)必須是替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)所要代表的牙科治療機(jī)中最不利的型號(hào)或配置（當(dāng)制造商可提供一種以上的型號(hào)或配置時(shí)）。替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)應(yīng)準(zhǔn)確地重建牙科治療機(jī)內(nèi)部供水系統(tǒng)，包括治療用水系統(tǒng)中所有含水元件的設(shè)計(jì)、構(gòu)造、配置和操作。其他不直接與治療用水接觸或控制治療用水流量的元件，如結(jié)構(gòu)性和裝飾性元件，則不必包括在內(nèi)。替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)的元件應(yīng)與其所代表的牙科治療機(jī)中的元件處于相同的環(huán)境條件（即光照和溫度）。
試驗(yàn)設(shè)備中應(yīng)包括符合YY/T 1043.2-2018防回流要求的任一氣隙系統(tǒng)或其他防回流裝置，用于將治療用水與進(jìn)水隔離。
替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)應(yīng)重建的關(guān)鍵要素包括：
——水路的配置（元件的放置、支線的布置、盲管段等）；
——管直徑；
——管長(zhǎng)度；
——管材料；
——與治療用水接觸或調(diào)節(jié)流量的其他元件（控制塞、閥門、配件等）；
——水處理裝置的位置（過(guò)濾器、自動(dòng)或被動(dòng)處理系統(tǒng)）。
牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)應(yīng)包括至少一條正常使用時(shí)向手機(jī)提供治療用水的軟管，以及一條正常使用時(shí)向多功能（氣/水）噴槍提供治療用水的軟管。通?？蓪⒅委熡盟?yīng)給連接到牙科治療機(jī)的其他器械的軟管包括在牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)中。通常從牙科治療機(jī)上取下并在患者之間進(jìn)行滅菌的牙科手機(jī)或其他器械或附件應(yīng)從軟管上斷開，如果可行，請(qǐng)勿用于本試驗(yàn)。
示例根據(jù)ISO 14457:2017，圖A.1，C點(diǎn)示例根據(jù)ISO 14457:2017，圖A.1，C點(diǎn)
痰盂沖洗水路應(yīng)與牙科治療機(jī)斷開連接，或從替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)中排除。痰盂漱口水路可以包括在牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)中。
注：基于其他水路在去除、防止和抑制生物膜方面將是更具挑戰(zhàn)性的試驗(yàn)環(huán)境的假設(shè)，允許排除痰盂水路。
6.1.2 抗菌材料和防止微生物粘附的材料的具體注意事項(xiàng)
如果要試驗(yàn)的牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)包括任何抗菌材料或防止微生物與治療用水粘附的材料，則應(yīng)對(duì)試驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行以下修改。
評(píng)估防止或抑制生物膜產(chǎn)生的試驗(yàn)設(shè)備：
——對(duì)照組的試驗(yàn)設(shè)備：對(duì)照組中任何抗菌材料或防止牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)中微生物粘附的材料均應(yīng)替換為不含抗菌劑或具有防粘附作用的材料，否則應(yīng)與抗菌材料基本一致。
——試驗(yàn)組的試驗(yàn)設(shè)備：試驗(yàn)組中的牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)應(yīng)包括（如適用）抗菌材料或防止微生物粘附的材料。
評(píng)估生物膜去除的試驗(yàn)設(shè)備：
——試驗(yàn)組的試驗(yàn)設(shè)備：試驗(yàn)組中任何抗菌材料或防止牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)中微生物粘附的材料均應(yīng)替換為不含抗菌劑或具有防粘附作用的材料，否則應(yīng)與抗菌材料基本一致。這對(duì)于評(píng)估試驗(yàn)處理方法去除生物膜的能力至關(guān)重要。
6.2 試驗(yàn)設(shè)備的操作
6.2.1 流動(dòng)速率
手機(jī)治療用水的流速應(yīng)調(diào)整為(30 ± 3) ml/min。
多功能（氣/水）噴槍的水流速應(yīng)調(diào)整為(60 ± 6) ml/min。
如果試驗(yàn)設(shè)備包括其他提供治療用水的儀器或器械，則應(yīng)根據(jù)制造商的建議調(diào)整這些儀器或設(shè)備的流速。
所有流速應(yīng)在試驗(yàn)開始之前進(jìn)行設(shè)置。在整個(gè)試驗(yàn)期間，如有必要，應(yīng)每周至少檢查和調(diào)整一次流速。
6.2.2 流動(dòng)方式（開-關(guān)循環(huán)）
試驗(yàn)設(shè)備的水路應(yīng)每周連續(xù)運(yùn)行五天，并連續(xù)兩天處于閑置狀態(tài)不運(yùn)行。水路運(yùn)行的幾天，應(yīng)按 5.3的規(guī)定新鮮制備接種的試驗(yàn)用水，供給試驗(yàn)設(shè)備。水流模式應(yīng)由一個(gè)循環(huán)30次組成的自動(dòng)日流量程序控制，該程序根據(jù)以下細(xì)則定期運(yùn)行試驗(yàn)設(shè)備水路。
——每個(gè)循環(huán)手機(jī)治療用水運(yùn)行30s。如果存在一個(gè)以上提供治療用水的手機(jī)，則每個(gè)循環(huán)中只能運(yùn)行一個(gè)手機(jī)治療水路。所選的手機(jī)治療水路應(yīng)隨每個(gè)循環(huán)順序改變，以確保在整個(gè)日流量程序中，每個(gè)手機(jī)治療水路的操作大致相同。
——每個(gè)循環(huán)運(yùn)行噴槍用水30s。如果存在一個(gè)以上的噴槍，則每個(gè)循環(huán)中只能運(yùn)行一個(gè)噴槍。所選的噴槍應(yīng)隨每個(gè)循環(huán)順序改變，以確保在整個(gè)日流量程序中每個(gè)噴槍的操作大致相同。
——每個(gè)循環(huán)應(yīng)有9min無(wú)任何水流。
如果試驗(yàn)設(shè)備中包括手機(jī)和噴槍以外的其他器械，則其操作應(yīng)以與其預(yù)期臨床用途一致的方式納入日流量程序。
6.2.3 試驗(yàn)環(huán)境溫度和預(yù)處理過(guò)程
試驗(yàn)環(huán)境的溫度應(yīng)保持在(23 ± 3) °C。在開始試驗(yàn)前，所有設(shè)備應(yīng)處于此溫度條件范圍內(nèi)至少24小時(shí)。
7 試驗(yàn)方法
7.1 試驗(yàn)順序
試驗(yàn)應(yīng)按以下順序進(jìn)行：
——根據(jù)7.2進(jìn)行評(píng)估生物膜的防止或抑制的試驗(yàn)；
——根據(jù)7.3進(jìn)行評(píng)估生物膜去除的試驗(yàn)。
注：該順序可減少試驗(yàn)設(shè)備和程序步驟的數(shù)量，因?yàn)樵谕瓿?.2后，已建立的生物膜對(duì)照組設(shè)備可用作7.3中的試驗(yàn)組設(shè)備。
7.2 防止或抑制生物膜的產(chǎn)生
7.2.1 概述
圖1描述了用于評(píng)估旨在防止或抑制牙科水路中生物膜形成的處理方法的試驗(yàn)方法。
試驗(yàn)組：
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根據(jù)制造商說(shuō)明對(duì)試驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行預(yù)處理
(7.2.2)
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接種試驗(yàn)用水和防止或抑制生物膜處理方法同時(shí)使用
（7.2.3）
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微生物取樣和測(cè)試
(7.2.4)
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結(jié)果分析
(7.2.6)
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對(duì)照組：
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根據(jù)制造商說(shuō)明對(duì)試驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行預(yù)處理
(7.2.2)
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使用接種試驗(yàn)用水
(7.2.3)
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微生物取樣和測(cè)試
(7.2.4)
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結(jié)果分析
(7.2.6)
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圖1-防止或抑制生物膜產(chǎn)生的評(píng)估試驗(yàn)方法流程圖
由于自然條件下生物膜結(jié)構(gòu)存在差異，因此試驗(yàn)應(yīng)在不同的牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)內(nèi)重復(fù)進(jìn)行。對(duì)于生物膜防止和抑制的試驗(yàn)方法，試驗(yàn)組應(yīng)包括至少兩個(gè)牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)，對(duì)照組應(yīng)包括包括至少兩個(gè)牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)。
7.2.2 試驗(yàn)設(shè)備的預(yù)運(yùn)行
如有規(guī)定，試驗(yàn)設(shè)備在試驗(yàn)正式開始前應(yīng)按照牙科治療機(jī)制造商的說(shuō)明書進(jìn)行預(yù)運(yùn)行。
例如，如果制造商的說(shuō)明書指出，在牙科治療機(jī)安裝后及使用前需執(zhí)行指定的消毒程序，則應(yīng)在執(zhí)行此試驗(yàn)方法之前執(zhí)行指定的消毒程序。
7.2.3 接種試驗(yàn)用水和防止或抑制生物膜處理方法同時(shí)使用
對(duì)于試驗(yàn)組，應(yīng)結(jié)合每個(gè)制造商說(shuō)明中的處理方法向牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)提供5.3中規(guī)定的接種試驗(yàn)用水。對(duì)于對(duì)照組，無(wú)需處理方法即可向牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)提供接種試驗(yàn)用水。所有牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)均應(yīng)按照6.2中的規(guī)定操作。應(yīng)每天在啟動(dòng)自動(dòng)日流量程序前兩小時(shí)內(nèi)制備接種試驗(yàn)用水。在供給試驗(yàn)設(shè)備之前，需按照8.1的規(guī)定對(duì)供給試驗(yàn)設(shè)備的接種試驗(yàn)用水進(jìn)行微生物取樣和測(cè)試，至少每周一次。
7.2.4 微生物取樣和測(cè)試
為確認(rèn)處理方法的有效性，試驗(yàn)組和對(duì)照組中的所有牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)的微生物取樣和測(cè)試過(guò)程應(yīng)按照8.1和8.2的規(guī)定進(jìn)行。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)至少每周一次按照8.1中的規(guī)定對(duì)所有牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)的活菌總數(shù)進(jìn)行取樣和測(cè)試。收集用于微生物試驗(yàn)的樣品時(shí)，應(yīng)向試驗(yàn)設(shè)備提供無(wú)菌試驗(yàn)用水（無(wú)接種物）。為清洗試驗(yàn)設(shè)備的所有水路，應(yīng)讓足夠量的無(wú)菌試驗(yàn)用水流出。然后，在進(jìn)行微生物測(cè)試取樣之前，應(yīng)將無(wú)菌試驗(yàn)用水在水路中放置5分鐘。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，應(yīng)按照8.2中的規(guī)定對(duì)所有牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)進(jìn)行至少一次的水路管取樣和生物膜的形成表征。
7.2.5 試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間
應(yīng)繼續(xù)按照 7.2.3和 7.2.4的規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)，直到滿足以下所有標(biāo)準(zhǔn)：
——至少進(jìn)行了四周的試驗(yàn)；
——當(dāng)將無(wú)菌試驗(yàn)用水代替接種試驗(yàn)用水臨時(shí)提供給試驗(yàn)設(shè)備時(shí)，對(duì)照組所有試驗(yàn)設(shè)備流出的治療用水中的活菌總數(shù)至少為104 CFU/ml。用無(wú)菌試驗(yàn)用水沖洗水路并等待5分鐘后再采集樣品，然后用接種試驗(yàn)用水恢復(fù)正常操作；
——按照8.2的規(guī)定，在對(duì)照組的所有牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)中都確認(rèn)存在生物膜，而對(duì)照組中的所有樣品管中，微生物和/或生物膜被分類為半流體覆蓋或大量流體覆蓋。
在滿足以上所有標(biāo)準(zhǔn)后，應(yīng)盡快按照7.3的規(guī)定進(jìn)行評(píng)估生物膜去除情況的試驗(yàn)方法。應(yīng)繼續(xù)執(zhí)行本條款規(guī)定的對(duì)照組使用接種試驗(yàn)用水的日常程序，直到按照 7.3的規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)為止。
7.2.6 結(jié)果分析
防止或抑制生物膜的處理方法的有效性，應(yīng)通過(guò)報(bào)告以下內(nèi)容來(lái)表征：
——在試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組和對(duì)照組每周間隔一次按照8.1的規(guī)定對(duì)流出的治療用水中的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換活菌總數(shù)計(jì)數(shù)（平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和重復(fù)次數(shù)）；
——在試驗(yàn)期間，每種類型的水路出口的試驗(yàn)組和對(duì)照組的平均對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換活菌總數(shù)之間的差值；
——在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采用雙尾t檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換活菌總數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較，執(zhí)行的顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05；
——按照8.2的規(guī)定在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組取樣的每種類型水路的生物膜覆蓋率進(jìn)行比較。
7.3 生物膜去除
7.3.1 概述
圖2描述了用于評(píng)估旨在去除牙科治療機(jī)水路生物膜的處理方法的試驗(yàn)方法的流程圖。
試驗(yàn)組：
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初次微生物取樣和測(cè)試
(7.3.2)
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使用接種試驗(yàn)用水在去除生物膜的處理方法中的應(yīng)用
(7.3.3)
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最終微生物取樣和測(cè)試
(7.3.4)
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結(jié)果分析
(7.3.5)
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圖2——評(píng)估生物膜去除的試驗(yàn)方法流程圖
對(duì)于生物膜去除試驗(yàn)方法，試驗(yàn)組應(yīng)至少包括兩個(gè)牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)，而在單獨(dú)的對(duì)照組中則不需要牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)。試驗(yàn)組設(shè)備應(yīng)由7.2中規(guī)定使用的對(duì)照組設(shè)備組成，在7.2完成后，說(shuō)明其含有已建立的生物膜。
注：對(duì)于生物膜去除試驗(yàn)方法不需要單獨(dú)的對(duì)照組，因?yàn)樵诓扇√幚矸椒ㄖ?，生物膜形成期可用于證明在不采取處理方法時(shí)生物膜也能夠形成。
7.3.2 初次微生物取樣和測(cè)試
在采取生物膜去除處理方法之前，應(yīng)立即按照8.1的規(guī)定對(duì)所有牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)進(jìn)行微生物取樣和測(cè)試。收集用于微生物測(cè)試的樣品時(shí)，應(yīng)向試驗(yàn)設(shè)備提供無(wú)菌試驗(yàn)用水（無(wú)接種物）。為清洗試驗(yàn)設(shè)備的所有水路，應(yīng)讓足夠量的無(wú)菌試驗(yàn)用水流出。然后，在進(jìn)行微生物測(cè)試取樣之前，應(yīng)將無(wú)菌試驗(yàn)用水在水路中放置5分鐘。
在采取生物膜去除處理方法之前，應(yīng)立即按照8.2的規(guī)定對(duì)所有牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)的水路管進(jìn)行取樣并對(duì)生物膜進(jìn)行表征。
7.3.3 生物膜去除處理方法的應(yīng)用
去除已形成的生物膜的處理方法應(yīng)當(dāng)根據(jù)牙科治療機(jī)或水處理系統(tǒng)制造商提供的說(shuō)明書進(jìn)行。
如果制備或?qū)嵤┨幚矸椒ㄐ枰盟?，則應(yīng)使用接種試驗(yàn)用水。
7.3.4 最終微生物取樣和測(cè)試
為確定處理方法的有效性，在采取生物膜去除處理方法后，應(yīng)立即按照8.1和8.2對(duì)所有牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)進(jìn)行微生物取樣和測(cè)試。收集樣品時(shí)，應(yīng)按照8.1的規(guī)定向試驗(yàn)設(shè)備提供無(wú)菌試驗(yàn)用水（無(wú)接種物）。
為清洗試驗(yàn)設(shè)備的所有水路，應(yīng)讓足夠量的無(wú)菌試驗(yàn)用水流出。然后，在進(jìn)行微生物測(cè)試取樣之前，應(yīng)將無(wú)菌試驗(yàn)用水在水路中放置5分鐘。
采取生物膜去除處理方法后，應(yīng)按照 8.2的規(guī)定對(duì)所有牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)的水路管進(jìn)行取樣，并對(duì)生物膜進(jìn)行表征。
應(yīng)考慮確定實(shí)施處理之后按照8.1和8.2的規(guī)定在最適的時(shí)間取樣。若制造商規(guī)定使用治療用水或其他溶液進(jìn)行沖洗，則此過(guò)程應(yīng)在取樣和測(cè)試之前進(jìn)行。
7.3.5 結(jié)果分析
生物膜去除處理方法的有效性應(yīng)通過(guò)報(bào)告以下內(nèi)容來(lái)表征：
——在實(shí)施生物膜去除處理方法之前和之后，根據(jù)8.1的規(guī)定對(duì)流出的治療用水中的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換活菌總數(shù)計(jì)數(shù)（平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和重復(fù)次數(shù)）；
——流出的治療用水中對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換活菌總數(shù)計(jì)數(shù)的減少值（即實(shí)施處理方法之前的平均值與實(shí)施該處理方法之后的平均值之間的數(shù)值差）；
——在實(shí)施處理方法之前和之后，采用雙尾t檢驗(yàn)對(duì)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換活菌總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較，執(zhí)行的顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05；
——按照8.2的規(guī)定在實(shí)施生物膜去除處理方法之前和之后對(duì)取樣的每個(gè)水路的生物膜覆蓋率進(jìn)行比較。
8 微生物取樣和測(cè)試
8.1 治療用水中細(xì)菌水平的計(jì)數(shù)
8.1.1 取樣
8.1.1.1 概述
取樣應(yīng)符合ISO 19458的規(guī)定。計(jì)數(shù)應(yīng)在取樣后24小時(shí)內(nèi)開始。如果不能在取樣時(shí)間的30分鐘內(nèi)開始計(jì)數(shù)，則應(yīng)將樣品保存在(4 ± 2) °C下。
如適用，所有試驗(yàn)樣品在采集時(shí)應(yīng)立即進(jìn)行處理，以中和任何殘留的抗菌劑。可采用的方法包括：使用中和劑或用0.2μm薄膜過(guò)濾器對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行薄膜過(guò)濾，然后用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液沖洗。如果使用了中和劑，應(yīng)通過(guò)中和作用驗(yàn)證其有效性和與細(xì)菌的相容性。對(duì)照組樣品和試驗(yàn)組樣品應(yīng)做相同處理。
8.1.1.2 對(duì)供給試驗(yàn)設(shè)備的水取樣
在規(guī)定的取樣時(shí)間內(nèi)，應(yīng)采集并分析至少50ml供給試驗(yàn)設(shè)備的接種試驗(yàn)用水的樣品。
8.1.1.3 對(duì)從試驗(yàn)設(shè)備輸出的水取樣
在規(guī)定的取樣時(shí)間內(nèi)，應(yīng)從每個(gè)規(guī)定的牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)的各個(gè)出水口無(wú)菌采集一個(gè)治療用水的復(fù)合樣品，并從每個(gè)出水口中采集大約相等的體積，使每個(gè)牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)的復(fù)合樣品的總體積在50ml至100ml之間。另外，也可以從每個(gè)規(guī)定的牙科治療機(jī)或替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)的每個(gè)出水口單獨(dú)采集樣品單獨(dú)進(jìn)行分析。
8.1.2 活菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)方法
活菌總數(shù)計(jì)數(shù)應(yīng)通過(guò)涂布平板培養(yǎng)法確定。每個(gè)試驗(yàn)樣品應(yīng)制備從100(即未稀釋)到10-3(在無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中)的十倍系列稀釋液，一式三份。如果預(yù)期結(jié)果落在一定范圍內(nèi)，則可以制備較少的稀釋液，一式三份。每種稀釋液取1.0ml或0.10ml涂在R2A瓊脂培養(yǎng)基上，留出足夠的時(shí)間使樣品吸收到瓊脂中，然后倒置并在(23 ± 3) °C的有氧條件下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后，應(yīng)對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并以CFU/ml為單位記錄活菌總數(shù)。每組樣品應(yīng)報(bào)告對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換活菌總數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（即以10為基數(shù)的活菌總數(shù)的對(duì)數(shù)）。
8.1.3 備選活菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)方法
浮游細(xì)菌的水平也可以通過(guò)薄膜過(guò)濾法進(jìn)行計(jì)數(shù)。例如，如果沒(méi)有已知或可用的中和樣品中殘留的抗菌劑的實(shí)用方法，則此方法適用。應(yīng)制備三組從100(即未稀釋)到10-4(在無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中)的十倍系列稀釋液，并對(duì)每種稀釋液進(jìn)行10ml的測(cè)試。如果預(yù)期結(jié)果落在一定范圍內(nèi)，則可以制備較少的稀釋液，一式三份。樣品或稀釋的樣品經(jīng)過(guò)薄膜過(guò)濾后，如果任何樣品中都可能存在抗菌劑，則應(yīng)過(guò)濾10ml等量的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液對(duì)薄膜進(jìn)行兩次沖洗。將薄膜轉(zhuǎn)移到R2A瓊脂培養(yǎng)基上，確保薄膜和培養(yǎng)基之間沒(méi)有氣泡，并在（23±3）°C的有氧條件下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)結(jié)束后，菌落應(yīng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并以CFU/ml為單位記錄。每組樣品應(yīng)報(bào)告對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換活菌總數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
8.2 水路表面的生物膜
8.2.1 取樣
在規(guī)定的取樣時(shí)間內(nèi)，應(yīng)通過(guò)無(wú)菌方式從每個(gè)水路出口端附近取樣一段至少1cm的水路管。如適用，應(yīng)使用經(jīng)滅菌的配件重新連接留在試驗(yàn)設(shè)備上的剩余長(zhǎng)度的管段，以使試驗(yàn)?zāi)軌蚶^續(xù)進(jìn)行。
固定后和脫水前，應(yīng)將樣品管縱向分成大致相等的兩半（見 8.2.2)。為了減少縱向分割樣品時(shí)從管表面去除任何生物膜的可能性，切割方向應(yīng)平行于管軸線。
8.2.2 生物膜評(píng)估試驗(yàn)方法
應(yīng)使用掃描電鏡(SEM)檢查每個(gè)樣品管的兩半管腔表面上的生物膜覆蓋率。應(yīng)以適用于對(duì)管表面生物膜進(jìn)行SEM分析的方式，通過(guò)固定、脫水、干燥、安裝和用導(dǎo)電材料濺射涂覆來(lái)制備SEM樣品。
示例 以下是SEM制備步驟的一種可能方法：
——用含2%戊二醛的0.1mol/l二甲胂酸鈉緩沖液中于室溫下固定樣品管30分鐘至4小時(shí)，然后用不含戊二醛的二甲胂酸鈉緩沖液沖洗3次；
——在一系列乙醇濃度不斷增加的乙醇水溶液（包括30％、50％、70％、90％、95％和100％）中對(duì)樣品管分別進(jìn)行10分鐘的脫水；
——樣品管的臨界點(diǎn)干燥；
——使用雙面導(dǎo)電膠帶將樣品管固定到SEM短柱上；
——用金-鈀對(duì)樣品管進(jìn)行濺射涂覆。
SEM儀器和操作參數(shù)的選擇應(yīng)能夠產(chǎn)生圖像，以分辨用于接種試驗(yàn)用水的規(guī)定細(xì)菌（如果存在于樣品管表面）。
另外，環(huán)境掃描電鏡(ESEM)可在分析前不經(jīng)固定、脫水、干燥或?yàn)R射涂覆而使用。
最初以小于1 000X的放大率掃描樣品管。對(duì)于每個(gè)樣品管的每一半，至少選擇三個(gè)具有代表性的生物膜覆蓋（或無(wú)覆蓋）的位置，并以1000 X至5000 X的放大率進(jìn)行檢查。在每個(gè)選定位置拍攝并記錄具有代表性的顯微照片。
對(duì)于每個(gè)樣品管，應(yīng)按照以下類別定性評(píng)估生物膜覆蓋率：
——無(wú)微生物，無(wú)生物膜；
——微生物和/或生物膜的單獨(dú)出現(xiàn)（即通常在樣品管整個(gè)表面上的覆蓋率小于約10％）；
——微生物和/或生物膜的半流體覆蓋（即通常在樣品管整個(gè)表面上的覆蓋率小于約50％）；
——微生物和/或生物膜的大量流體覆蓋（即通常在樣品管整個(gè)表面上覆蓋大于約50％）。
檢驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)包括每個(gè)樣品管覆蓋最嚴(yán)重區(qū)域的代表性圖像。
9 檢驗(yàn)報(bào)告
檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括如下內(nèi)容：
a) 試驗(yàn)的牙科治療機(jī)或試驗(yàn)中使用的替代牙科治療機(jī)用水系統(tǒng)所代表的牙科治療機(jī)；
b)牙科治療機(jī)內(nèi)部供水系統(tǒng)處理方法的檢測(cè)；
c)試驗(yàn)設(shè)備的設(shè)計(jì)和操作；
d)使用的試驗(yàn)方法，包括具體的試驗(yàn)參數(shù)；
e)試驗(yàn)中使用的細(xì)菌；
f)試驗(yàn)中使用的微生物取樣和檢驗(yàn)方法；
g)檢驗(yàn)結(jié)果、分析和結(jié)論；
h)任何可能影響結(jié)果及其有效性的情況和條件；
i)試驗(yàn)中任何偏離規(guī)定測(cè)試方法的情況；
j)參照的標(biāo)準(zhǔn)，（如YY/T XXXX/ISO 16954:2015, MOD）；
k)檢驗(yàn)負(fù)責(zé)人姓名和檢驗(yàn)室名稱；
l)檢驗(yàn)人員姓名；
m)檢驗(yàn)日期；
n)檢查員的觀察結(jié)果；
o)授權(quán)簽字人簽發(fā)的日期。
參考文獻(xiàn)
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[14]ISO 14457:20121), Dentistry —Handpieces and motors
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京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
