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有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)的定量方法根據(jù)雜質(zhì)與主成分的最大吸收波長及校正因子來確定。若雜質(zhì)與主峰的吸收波長基本一致，則一般采用自身對照法或峰面積歸一化法；若雜質(zhì)與主峰的吸收波長差異范圍較小，校正因子在0.9～1.1之間，則可采用不加校正因子的主成分自身對照法；超出該范圍，校正因子在0.2～5.0范圍以內(nèi)時，采用主成分自身對照法的定量方式，須用校正因子進(jìn)行校正；若雜質(zhì)與主峰的吸收波長相差較大，校正因子在0.2～5.0范圍以外時，不能通過校正因子校正，則要采用外標(biāo)法進(jìn)行測定。

 

①外標(biāo)法（雜質(zhì)對照品法）

 

 外標(biāo)法定量比較準(zhǔn)確，采用外標(biāo)法進(jìn)行測定時，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)研究。

 

       A 檢測波長的選擇   檢測波長的選擇測定方法參照紫外-可見分光光度法進(jìn)行測定，或采用HPLC法，DAD檢測器進(jìn)行測定。同時考察輔料干擾等。

 

       B 標(biāo)準(zhǔn)曲線 線性關(guān)系應(yīng)在設(shè)計的測定范圍內(nèi)測定?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列被測物質(zhì)濃度系列進(jìn)行測定，至少制備5個濃度。以測得的響應(yīng)信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。

 

       C 精密度試驗  儀器精密度試驗主要是考察測定方法在所用的試驗儀器測定結(jié)果的偏差，精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

 

       測定方法：取一定濃度的雜質(zhì)對照品溶液，連續(xù)測定次數(shù)至少6次，以峰面積的測定結(jié)果計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察儀器測定的。

 

       D重復(fù)性試驗   重復(fù)性系指在同樣的操作條件下，在較短時間間隔內(nèi)，由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度。重復(fù)性測定可在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果進(jìn)行評價，如制備3個不同濃度的試樣，各測定3次，或100％的濃度水平，用至少測定6次的結(jié)果進(jìn)行評價。常用的測定方法時采用100%的濃度，測定6次，計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

 

       測定方法:按含量測定的方法，分別平行稱取6份樣品，按外標(biāo)法測定雜質(zhì)的含量，以雜質(zhì)含量測定結(jié)果計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

 

      E 中間精密度   中間精密度系指在同一實驗室，由于實驗室內(nèi)部條件改變，如時間、分析人員、儀器設(shè)備、測定結(jié)果的精密度。驗證設(shè)計方案中的變動因素一般為日期、分析人員、設(shè)備。考察在不同因素變動的條件下，測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

 

       測定方法：按含量測定的方法，分別由不同的人員、時間、不同儀器按外標(biāo)法測定樣品雜質(zhì)的含量，以雜質(zhì)含量測定結(jié)果計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

 

       F 回收率試驗   回收率試驗來驗證測定方法的準(zhǔn)確度。試驗設(shè)計需考慮在規(guī)定范圍內(nèi)，制備3個不同濃度的試樣，各測定3次，即測定9次，報告已知加入量的回收率（％）或測定結(jié)果平均值與真實值之差及其可信限。并考察不同濃度下測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

 

       測定方法：按含量測定的方法，按加樣回收率測定方法，在已知雜質(zhì)含量的樣品中加入不同濃度的雜質(zhì)對照品，按外標(biāo)法分別測定不同濃度樣品中的測的量，計算測的量比加入量的百分含量（即回收率），以不同濃度下的回收率計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

 

      G 雜質(zhì)的檢測限    檢測限系指試樣中的被分析物能夠被檢測到的最低量，是反映分析方法靈敏度的一個重要指標(biāo)；最低檢測限不得大于該雜質(zhì)的報告限度，以保證檢出需控制的雜質(zhì)。

 

      測定方法：取待測物質(zhì)對照品適量，加流動相配制成一點濃度的對照品溶液，按倍倍稀釋法，以信噪比為3：1時相應(yīng)的濃度或注入儀器的量確定檢測限。同時將信噪比為3：1的樣品溶液進(jìn)樣6針，以峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

 

      判斷結(jié)果：最小檢測限濃度下樣品峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤20%，以最小檢測限來確定供試品溶液配制的濃度作為依據(jù)。

 

       H 雜質(zhì)的定量限   定量限是指被測雜質(zhì)能夠被定量測定的最低量。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。雜質(zhì)定量試驗，需考察方法的定量限，以保證含量很少的雜質(zhì)能夠被準(zhǔn)確測出。

 

       測定方法：取待測物質(zhì)對照品適量，加流動相配制成一點濃度的對照品溶液，按倍倍稀釋法，以信噪比為10：1時相應(yīng)的濃度或注入儀器的量確定檢測限。同時將信噪比為10：1的樣品溶液進(jìn)樣6針，以峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

 

       判斷結(jié)果：定量限濃度下樣品峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤10%。

 

②加校正因子的主成分自身對照法

 

      采用加校正因子自身對照法應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)雜質(zhì)的校正因子的測定，僅適用于已知雜質(zhì)的控制，如果校正因子在0.2～5.0的范圍內(nèi)也可用加校正因子的主成分自身對照法。

 

       校正因子的定義及特點一般來講，HPLC定量測定中，物質(zhì)的檢測量W與色譜響應(yīng)值（峰面積等）A之間的比值稱為絕對校正因子，即單位響應(yīng)值（峰面積等）所對應(yīng)的被測物質(zhì)的量（濃度或質(zhì)量）；而某物質(zhì)i與所選定的參照物質(zhì)s的絕對校正因子之比，即為相對校正因子，即通常所講的校正因子。但這種方法有時會因不同儀器及色譜條件的波動，可產(chǎn)生一定范圍的誤差，需進(jìn)行充分的方法耐用性驗證，并結(jié)合色譜峰定位控制等措施，將誤差控制在一定范圍內(nèi)。

 

校正因子測定的要求

 

      A 測定校正因子的各雜質(zhì)與主成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（對照品），應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（對照品）的要求。

 

      B 確定校正因子的分析方法應(yīng)與最終確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法一致，色譜條件等需經(jīng)篩選優(yōu)化后確定，如有變更，需考慮對校正因子的影響，必要時重新確定。

 

      C 要關(guān)注影響待測物UV吸收的各種因素，如溶液制備所用溶劑最好與最終確定的流動相相同，檢測波長最好在特定雜質(zhì)及主成分UV曲線的峰或谷處，避開吸收值急劇變化波段，以保證測定方法具有較好的耐用性，并保持測定結(jié)果的恒定。

 

校正因子的測定：

 

A 單濃度點測定：制備適當(dāng)濃度的特定雜質(zhì)對照品溶液和主成分對照品溶液，分別進(jìn)樣測定，待測樣品的絕對校正因子與參照樣品絕對校正因子的比，得到校正因子。

 

B 多濃度點測定：制備適當(dāng)?shù)母摺⒅?、低三水平濃度的特定雜質(zhì)對照品溶液和主成分對照品溶液（涵蓋定量限、標(biāo)準(zhǔn)限度），分別進(jìn)樣測定，同法進(jìn)行分別各點計算，求平均值，計算RSD，得到校正因子。

 

C 標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定：精密稱取雜質(zhì)對照品和主成分對照品，分別制備系列溶液（涵蓋定量限、標(biāo)準(zhǔn)限度），分別進(jìn)樣后，按最小二乘法以進(jìn)樣量對響應(yīng)值（峰面積等）進(jìn)行線性回歸，求得兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩曲線斜率之比即為校正因子。

 

D 吸收系數(shù)比值法：對于UV檢測器來講，兩物質(zhì)的相對校正因子實際上也是兩物質(zhì)以流動相為溶劑，在檢測波長處的紫外吸收系數(shù)E1cm1%之比，故可按吸收系數(shù)法測定法的相關(guān)技術(shù)要求測定各自吸收系數(shù)，如對照品級別的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、高中低三水平濃度測定、吸收度介于0.3～0.8之間、至少5臺不同型號的UV分光光度計、2份供試液同時平行制備測定、同臺儀器2份供試液的平行測定結(jié)果不超過±0.5%等。測定兩物質(zhì)的吸收系數(shù)后，經(jīng)統(tǒng)計分析確定兩物質(zhì)吸收系數(shù)，計算比值，求得校正因子。

 

測定方法的選擇：上述各方法中，A和B法較為簡捷，可以快捷地量化特定雜質(zhì)與主成分紫外吸收特征的差異，多用于評估采用主成分自身對照法定量雜質(zhì)時是否需要校正。但如采用加校正因子的主成分自身對照法定量雜質(zhì)，需將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)賦值信息轉(zhuǎn)化為校正因子固化在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，那么校正因子的準(zhǔn)確性非常關(guān)鍵，校正因子的準(zhǔn)確計算應(yīng)符合更為嚴(yán)格的要求，需要考慮并控制求算校正因子過程中的各種誤差因素，以及儀器通用性和色譜系統(tǒng)的耐用性等因素，以便使求得的常數(shù)更為準(zhǔn)確并具代表性，此時采用C、D法更為適宜，如能考慮到測定人員、不同試驗室因素的影響，會更加符合常數(shù)求算的基本要求。

 

      在采用校正因子測定雜質(zhì)的時候，要有加校正因子定量方式的合理性和測定結(jié)果的準(zhǔn)確性的試驗對比研究數(shù)據(jù)（研究數(shù)據(jù)應(yīng)包括雜質(zhì)對照品外標(biāo)法、加校正因子的主成分自身對照法、不加校正因子的主成分自身對照法對相同多批樣品雜質(zhì)定量測定結(jié)果的對比數(shù)據(jù)，作為是否需要校正或能否有效校正檢測結(jié)果的支持與依據(jù)）。

 

③不加校正因子的主成分自身對照法（自身對照法）

 

      不加校正因子的主成分自身對照法（自身對照法）是雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子基本相同（校正因子在0.9～1.1）。一般情況下，如雜質(zhì)與主成分的分子結(jié)構(gòu)相似，其響應(yīng)因子差別不會太大。

 

      測定方法：稱取供試品樣品適量，加適當(dāng)溶劑配制成一定濃度的供試品溶液；精密量取供試品溶液稀釋到一定濃度，一般1%或2%，作為對照溶液；量取供試品溶液中的雜質(zhì)峰面積與對照溶液峰面積相比乘以稀釋濃度即為供試品溶液中的雜質(zhì)的含量。

 

④峰面積歸一化法

 

       峰面積歸一化法測定有關(guān)物質(zhì)簡便快捷，但因各雜質(zhì)與主成分響應(yīng)因子不一定相同、雜質(zhì)量與主成分量不一定在同一線性范圍內(nèi)、儀器對微量雜質(zhì)和常量主成分的積分精度及準(zhǔn)確度不相同等因素，所以在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中一般不采用峰面積歸一化法計算有關(guān)物質(zhì)。