中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

確保生物治療產(chǎn)品的穩(wěn)定性對(duì)其安全性和有效性有關(guān)鍵影響，這仍然是生物制藥行業(yè)面臨的主要挑戰(zhàn)。單克隆抗體(mAb)尤其如此，它是當(dāng)今大多數(shù)商業(yè)化生物藥物的來(lái)源。聚集和化學(xué)修飾（例如片段化）等物理效應(yīng)是mAb降解的兩條主要途徑。動(dòng)力學(xué)建?？梢猿蔀榻a(chǎn)品穩(wěn)定性的有效工具，提供對(duì)這些過(guò)程的更深入了解，并允許開發(fā)人員在過(guò)程和產(chǎn)品開發(fā)的早期階段降低產(chǎn)品降解的風(fēng)險(xiǎn)。

 

蛋白質(zhì)穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)

 

單克隆抗體是目前領(lǐng)先的一類蛋白質(zhì)治療分子，因?yàn)樗鼈兡軌蛑委煻喾N致命和危及生命的疾病，包括癌癥、埃博拉、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和哮喘。FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了許多抗體藥物分子，它們處于臨床和臨床前開發(fā)的各個(gè)階段。但由于最終藥物產(chǎn)品的主要成分是蛋白質(zhì)，因此這些藥物分子的穩(wěn)定性存在重大風(fēng)險(xiǎn)。

 

與各種關(guān)鍵質(zhì)量屬性（例如，聚集、斷裂、電荷變異和糖基化）相關(guān)的不穩(wěn)定性仍然是生物制藥行業(yè)的主要問(wèn)題。它可以直接或間接地影響mAb的生物學(xué)活性和藥效。

 

與mAb相關(guān)的不穩(wěn)定性可以大致分為物理或化學(xué)兩個(gè)方面。聚集是主要的物理不穩(wěn)定性之一，被認(rèn)為會(huì)影響治療制劑的免疫原性。

 

不同類型的化學(xué)不穩(wěn)定性包括脫酰胺、氧化、斷裂和水解。盡管這些不穩(wěn)定性（物理和化學(xué)）的影響可能因不同類別的mAb分子而不同，但生物制藥制造企業(yè)希望將它們降至最低。聚集和斷裂是mAb的兩個(gè)最重要的降解途徑。它們會(huì)在產(chǎn)品開發(fā)的各個(gè)階段出現(xiàn)不穩(wěn)定，包括上游加工（細(xì)胞培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)表達(dá)期間）、下游加工（純化）、產(chǎn)品配方開發(fā)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸。

 

影響mAb穩(wěn)定性的因素

 

影響mAb治療制劑穩(wěn)定性的因素可能與其結(jié)構(gòu)（一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)）或環(huán)境有關(guān)。在一級(jí)結(jié)構(gòu)中，如果蛋白質(zhì)的表面電荷分布或疏水性發(fā)生變化，則會(huì)變得不穩(wěn)定。二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，尤其是蛋白質(zhì)分子β含量的增加，會(huì)使其更容易聚集。可能對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響的環(huán)境因素包括pH值、溫度、鹽濃度、緩沖液類型、蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度、混合、剪切力、金屬離子、壓力、凍融、冷凍干燥和重構(gòu)。

 

蛋白質(zhì)可能會(huì)因?yàn)檫@些因素而發(fā)生變化，通過(guò)物理結(jié)合（聚集）或化學(xué)降解（碎片）來(lái)改變其物理結(jié)構(gòu)。這篇文章討論了這些降解途徑的動(dòng)力學(xué)以及揭示可幫助開發(fā)人員確保生物制劑產(chǎn)品穩(wěn)定性的見解。

 

研究案例1：mAb產(chǎn)品的聚合

 

模擬蛋白質(zhì)聚集的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)對(duì)于理解其機(jī)制很有價(jià)值。與動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)相關(guān)的蛋白質(zhì)聚集的數(shù)學(xué)建模可以幫助開發(fā)人員獲得對(duì)聚集背后機(jī)制的定性和定量見解。有了這些知識(shí)，開發(fā)人員可以通過(guò)優(yōu)化時(shí)間框架和環(huán)境條件來(lái)更好地預(yù)測(cè)和控制抗體聚合。

 

許多蛋白質(zhì)聚集模型已經(jīng)存在，包括Lumry-Eyring模型，它是預(yù)測(cè)聚集動(dòng)力學(xué)最常用的模型之一。根據(jù)該模型，聚集發(fā)生在兩個(gè)步驟中：蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象可逆展開，然后不可逆地組裝成聚體，它們彼此使用物理或化學(xué)連接。

 

許多研究人員修改了Lumry-Eyring模型以解釋成核和更高級(jí)聚集的產(chǎn)生。例如擴(kuò)展的Lumry-Eyring(ELE)模型和Lumry-Eyring成核聚集(LENP)模型。此外，替代模型已經(jīng)提出了諸如朊病毒、淀粉樣蛋白β和胰島素等蛋白質(zhì)的替代聚集模型。

 

Lumry-Eyring成核聚集(LENP)模型

 

Lumry-Eyring模型將成核的概念引入到聚集中。該模型中呈現(xiàn)的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)方案取決于：反應(yīng)順序、起始蛋白質(zhì)濃度和不同蛋白種類之間的粒度分布。

 

該模型中考慮的參數(shù)是核化學(xué)計(jì)量(x)、在每個(gè)生長(zhǎng)步驟中添加的單體(δ)以及成核和生長(zhǎng)的逆速率系數(shù)。這些速率系數(shù)表示相應(yīng)的時(shí)間尺度（τn和τg）。

 

Lumry-Eyring模型(ELE)

 

另一個(gè)用于聚集動(dòng)力學(xué)分析的模型是擴(kuò)展的Lumry-Eyring(ELE)模型。通過(guò)這種方法，展開被認(rèn)為是一種單一的可逆限速反應(yīng)，折疊的天然和反應(yīng)性未折疊單體物質(zhì)彼此處于熱力學(xué)平衡狀態(tài)。該模型考慮了聚集過(guò)程中發(fā)生的可逆和不可逆構(gòu)象變化。它還考慮了溶液的構(gòu)象和動(dòng)力學(xué)膠體穩(wěn)定性。將基于濃度的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合到模型方程中以計(jì)算表觀速率常數(shù)并預(yù)測(cè)單體降解速率。

 

聚合樣品制備和表征

 

為了監(jiān)測(cè)和了解蛋白質(zhì)中的聚集機(jī)制及其行為，選擇了等電點(diǎn)(pI)為8.5的模型蛋白質(zhì)(mAb)。在下游純化期間生物制藥行業(yè)普遍存在的條件下，使用緩沖液交換來(lái)監(jiān)測(cè)該mAb的聚集動(dòng)力學(xué)。

 

詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)程序和條件詳見參考文獻(xiàn)1。簡(jiǎn)而言之，所檢查的緩沖液包括那些常用于蛋白A層析、陽(yáng)離子交換層析和陰離子交換層析的緩沖液。

 

將樣品以10mg/mL的濃度保存在三種不同的溫度（4℃、15℃和30℃）下。在間歇時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了超過(guò)120小時(shí)的采樣。使用分子排阻高效液相色譜(SE-HPLC)分析樣品的聚體含量，并使用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)(如下圖1A)分析低聚物類型。

 

 

圖1：聚合表征、分析和建模數(shù)據(jù)。

 

所有實(shí)驗(yàn)樣品一式三份以確保重現(xiàn)性。使用MATLABR2011a分析SE-HPLC獲得的聚集數(shù)據(jù)并擬合到ELE和LENP模型中。然后使用高斯-牛頓算法求解常微分方程組(ODE)以估計(jì)模型參數(shù)。

 

影響mAb聚集的因素

 

發(fā)現(xiàn)聚集在低pH值下達(dá)到最大值，并隨著溫度和鹽濃度的增加而加速。低pH值下的聚集主要與抗體的可結(jié)晶片段(Fc)結(jié)構(gòu)域的變化有關(guān)。這些變化包括mAb Fc結(jié)構(gòu)域的部分解折疊，這導(dǎo)致疏水殘基暴露。這些之前埋在分子內(nèi)部的疏水殘基相互吸引。這導(dǎo)致在低pH值下聚集增強(qiáng)。上圖1B說(shuō)明與蛋白A純化條件（低pH）相比，在陽(yáng)離子和陰離子交換（CEX和AEX）緩沖條件（高pH）下聚集較少。此外，較高的溫度導(dǎo)致mAb結(jié)構(gòu)部分或完全展開，并由于蛋白質(zhì)分子在較高溫度下的不穩(wěn)定性而導(dǎo)致聚集（如上圖1B）。

 

鹽的存在也會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，其程度取決于鹽的類型、濃度、蛋白質(zhì)電荷以及蛋白質(zhì)和鹽的相互作用（如上圖1B）。隨著鹽濃度的增加，可以看到聚集速率的增加。除了這些因素之外，緩沖液種類的類型似乎對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性也有深遠(yuǎn)的影響。

 

與檸檬酸鹽和醋酸鹽緩沖液相比，甘氨酸緩沖液具有更高的穩(wěn)定性（如上圖1B），這取決于mAb分子的Fc結(jié)構(gòu)域與不同緩沖液種類的相互作用。從圓二色性(CD)光譜和DLS測(cè)量獲得的結(jié)果也支持這些觀察結(jié)果?？偨Y(jié)后發(fā)現(xiàn)，可以說(shuō)pH是蛋白質(zhì)聚集的最重要因素，其次是溫度、鹽濃度和緩沖液種類。

 

mAb聚集動(dòng)力學(xué)建模

 

使用ELE和LENP模型擬合從SE-HPLC分析獲得的數(shù)據(jù)，并通過(guò)將實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較評(píng)估來(lái)判斷模型的準(zhǔn)確性。使用兩種模型進(jìn)行曲線擬合以計(jì)算回歸系數(shù)（R2值）。模型比較發(fā)現(xiàn)LENP模型在預(yù)測(cè)聚集動(dòng)力學(xué)方面比ELE更好。

 

然后使用結(jié)果來(lái)計(jì)算成核(τn)和生長(zhǎng)(τg)的時(shí)間，以預(yù)測(cè)聚集動(dòng)力學(xué)（如上圖1C）。在不同的孵育條件下比較了成核和生長(zhǎng)時(shí)間的建模參數(shù)。注意到，隨著溫度從4℃增加到30℃（對(duì)于pH3.0的檸檬酸鹽緩沖液和100mM NaCl），成核和生長(zhǎng)時(shí)間減少，意味著更快的聚集(如上圖1C)。

 

隨著溫度從4℃增加到30℃，成核時(shí)間和單體半衰期之間也存在線性關(guān)系。高溫下更快的單體損失歸因于蛋白質(zhì)擴(kuò)散增加導(dǎo)致碰撞頻率增加。

 

在將鹽濃度從0mM NaCl增加到100mM NaCl時(shí)觀察到類似的效果（如上圖1C）。這可能是由于鹽離子化造成的，這會(huì)削弱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并降低穩(wěn)定性，因?yàn)殡S著鹽濃度的增加，疏水相互作用和靜電排斥力減弱。

 

總體而言，對(duì)于所考慮的系統(tǒng)，pH3.0的檸檬酸鹽緩沖液與乙酸鹽和甘氨酸緩沖液相比顯示出最快的單體損失（如上圖1C）。在不同條件下，成核時(shí)間和單體半衰期之間存在線性相關(guān)性，斜率在0.4-0.5之間，表明成核在mAb中占主導(dǎo)地位，因此LENP模型提供比ELE模型有更好的擬合（如上圖1C）。

 

研究案例2：mAb片段化

 

片段化包括將mAb分解成更小的單元，使用熱能或化學(xué)能進(jìn)行。斷裂會(huì)導(dǎo)致氨基酸之間的鍵斷裂，從而改變分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，并最終改變其他更高級(jí)的改變。mAb鉸鏈區(qū)肽鍵的裂解（水解）導(dǎo)致Fc-Fab和Fab的形成。

 

不同類別的mAb分子的響應(yīng)在碎片現(xiàn)象方面有所不同，具體取決于每個(gè)分子的遺傳一級(jí)結(jié)構(gòu)。制劑緩沖系統(tǒng)中的各種污染物（例如，金屬離子和蛋白酶）會(huì)顯著影響碎片化程度，并且降解可能發(fā)生在mAb生產(chǎn)和加工的各個(gè)階段。基于分子大小的監(jiān)測(cè)工具，例如SEC、DLS、質(zhì)譜(MS)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，通常用于檢測(cè)碎片并識(shí)別形成的各種物質(zhì)。

 

碎片樣品制備和表征

 

mAb樣品在配制緩沖液（15mM磷酸鹽，pH6.5，含150mM NaCl和0.02%聚山梨酯80）中超濾，最終濃度為5mg/mL。然后將該樣品在50℃下孵育，并通過(guò)SEC-HPLC定期監(jiān)測(cè)碎裂程度（如下圖2A和2B）。

 

 

圖2：碎片化表征、分析和建模數(shù)據(jù)。

 

各種其他分析技術(shù)（例如，DLS和SDS-PAGE）用于確認(rèn)形成的片段的大?。ㄈ缟蠄D2D）。使用帶質(zhì)譜的反相高效液相色譜(RPHPLC-MS)分析完整mAb樣品以及碎片化mAb樣品和純化和富集的片段種類，以定位mAb分子中的碎片化位點(diǎn)（如上圖2C)。

 

SEC、DLS、SDS-PAGE和MS分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在完整單體(148KDa)mAb分子片段1(96.9KDa)和片段2(47.3KDa)裂解后形成了兩種不同的片段種類（如上圖2C）和二維結(jié)構(gòu)。這表明斷裂發(fā)生在mAb的鉸鏈區(qū)，導(dǎo)致Fc-Fab和Fab片段的形成，與已發(fā)表的結(jié)果（參考文獻(xiàn)2）相對(duì)應(yīng)。 

 

mAb碎片動(dòng)力學(xué)建模

 

通過(guò)SEC觀察碎片趨勢(shì)，可以推斷單體mAb分子(M)隨著時(shí)間的推移分解為兩種物質(zhì)(F1和F2)。分析這三個(gè)物質(zhì)（M、F1和F2）濃度變化的時(shí)間趨勢(shì)，注意到，最初，在72小時(shí)內(nèi)，M的濃度緩慢下降，然后突然上升。F1和F2片段也以增量方式遵循這一趨勢(shì)（如上圖2A）。這種基于時(shí)間的分析是在不同溫度下進(jìn)行的，以證實(shí)我們的假設(shè)，碎片模型基于該假設(shè)。我們認(rèn)為碎片現(xiàn)象本質(zhì)上是自催化的，這是基于這樣一種假設(shè)，即需要一定濃度的碎片與完整的單體分子反應(yīng)以進(jìn)一步加速其降解。為了確認(rèn)所提出的模型在本質(zhì)上是通用的，它在另一個(gè)緩沖系統(tǒng)上進(jìn)行了測(cè)試，溫度為50℃（15mM磷酸鹽，離子強(qiáng)度-29mM，pH6.8和0.015%PS80）（如上圖2B）。

 

對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，雖然兩種緩沖液系統(tǒng)的碎片趨勢(shì)相同，但由于兩種緩沖液的離子強(qiáng)度不同，碎裂速度略有不同。大約57%的單體mAb在四天內(nèi)轉(zhuǎn)化為片段。碎裂的動(dòng)力學(xué)模型是基于從SEC獲得的結(jié)果。SEC分析表明，在整個(gè)研究過(guò)程中，聚體的百分比是恒定的，證明它們對(duì)破碎過(guò)程的影響較小。

 

碎片率的突然增加

 

此外，碎裂率最初是漸進(jìn)的，但在第四天突然增加，直到樣品完全降解。此外，觀察到單體峰旁邊的峰是第一種片段種類（F1或Fc-Fab），第二個(gè)峰是第二種片段種類（F2或Fab）。

 

F1的濃度在開始時(shí)增加然后減少。F2的濃度在整個(gè)研究過(guò)程中不斷增加。在檢查這些觀察結(jié)果時(shí)，提出了以下機(jī)制：

 

 

此外，該模型在三種不同的溫度（40℃、45℃和50℃）下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明反應(yīng)[1]為負(fù)活化能的非阿倫尼烏斯反應(yīng)（化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)隨溫度變化關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)公式）。這也在另外兩個(gè)溫度（30℃、35℃）下進(jìn)行了檢查。在所有五個(gè)溫度下，趨勢(shì)都是非阿倫尼烏斯，具有負(fù)活化能（如下表1）。

 

 

表1：對(duì)于在三個(gè)不同溫度下的相同樣品，獲得的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)。

 

通過(guò)對(duì)F1和F2進(jìn)行純化和收集，并將它們分別在50℃下孵育，證實(shí)了反應(yīng)[3]。F1(Fc-Fab)解離為Fc和Fab片段，發(fā)現(xiàn)F2片段是最終產(chǎn)物，之后樣品完全降解（如上圖2E）。

 

在所有速率常數(shù)中，雖然k1不遵循阿倫尼烏斯動(dòng)力學(xué)，但k3和k4遵循大于0.75的R2方程。此外，k3和k4表現(xiàn)出與對(duì)應(yīng)于增加的碎裂的溫度的線性關(guān)系（如下表2）。

 

 

表2：ln(k)與(1/T)的線性阿倫尼烏斯圖擬合的R2值。該表包括活化能值以及擬合方程。

 

MATLAB R2015b用于分析SEC-HPLC獲得的碎片數(shù)據(jù)，然后將其擬合到建議的模型方程中以獲得速率常數(shù)（如上圖2F）。對(duì)于所有片段種類，發(fā)現(xiàn)當(dāng)R2值大于0.9，證明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

 

總結(jié)

 

因?yàn)閙Ab是蛋白質(zhì)，所以mAb是高度敏感的不穩(wěn)定分子，很容易通過(guò)聚集和斷裂降解。本文討論了動(dòng)力學(xué)建模，并展示了如何將其用作早期評(píng)估蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的工具。