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2020 年，在新冠疫情爆發(fā)的背景下，mRNA 技術(shù)在歷經(jīng)多年發(fā)展后得到快速突破，mRNA 疫苗 95% 左右的保護(hù)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它傳統(tǒng)疫苗，讓這項(xiàng)技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室全面走向臨床。同時(shí)基于 mRNA 技術(shù)的靈活性，其可以廣泛應(yīng)用于疾病預(yù)防和癌癥治療等多個(gè)領(lǐng)域，因此在國內(nèi)外的研發(fā)得到了廣泛關(guān)注。

圖 1. 疫苗研發(fā)發(fā)展簡史

國外方面，Moderna、BioNTech 和 CureVac 作為先行者，多個(gè)產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入臨床。國內(nèi)方面，也掀起了一股 mRNA 研發(fā)熱潮，艾博、斯微和麗凡達(dá)在新冠疫苗研發(fā)上已經(jīng)先行，嘉晨西海、藍(lán)鵲生物、美諾恒康、深信生物、深圳瑞吉、厚存納米、吉瑪基因和本導(dǎo)基因等企業(yè)加速進(jìn)入研發(fā)行列，技術(shù)的應(yīng)用場景包括腫瘤疫苗、CART 療法、傳染性疾病疫苗、罕見病治療、基因編輯等多個(gè)方面。

此外復(fù)星醫(yī)藥、君實(shí)生物、康泰生物、沃森生物和天境生物等其他傳統(tǒng)藥物研發(fā)企業(yè)，也紛紛參與 mRNA 的產(chǎn)品和技術(shù)合作，藥明生物在杭州也已經(jīng)建好上億劑 mRNA 疫苗產(chǎn)能?？梢?mRNA 相關(guān)藥物研發(fā)生態(tài)圈在國內(nèi)已經(jīng)基本成型，有資本有產(chǎn)能，然而作為一項(xiàng)較新的技術(shù)，研發(fā)、工藝及生產(chǎn)方面能力還有待進(jìn)一步提升，助力產(chǎn)品的成功轉(zhuǎn)化。

圖 2. 各類型疫苗結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

從 mRNA 藥物的研發(fā)來看，抗原設(shè)計(jì)、載體的構(gòu)建、遞送技術(shù)和生產(chǎn)平臺搭建是 mRNA 藥物技術(shù)的四大核心元素。

抗原設(shè)計(jì)

抗原設(shè)計(jì)對于不同治療領(lǐng)域各有區(qū)別，對于細(xì)菌類的以糖蛋白為主，對于病毒類的以刺突蛋白為主，對于抗體相關(guān)的被動免疫療法，則有必要使用分開的抗原設(shè)計(jì)以解決分子量的限制問題。序列設(shè)計(jì)方面，mRNA疫苗需要選擇最接近人源性的同義密碼子，規(guī)避可能引起過敏反應(yīng)的組合以保證安全性和轉(zhuǎn)譯質(zhì)量，非轉(zhuǎn)譯區(qū)也會調(diào)控mRNA和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及表達(dá)效率。

載體的構(gòu)建

載體的構(gòu)建方面，5’ 的 Cap、抗原編碼區(qū)及 3’ 的 Poly A 尾巴為骨架元件，此外修飾的尿苷有助于抑制合成 mRNA 的免疫應(yīng)答，從而降低毒性并改善基因的翻譯，此前 CureVac 的臨床失敗可能和使用未修飾的尿苷。此外目前第一代 mRNA 藥物均是非復(fù)制性 mRNA，在劑量方面受到較大限制，復(fù)制型 mRNA 隨著復(fù)制子元件的加入，將顯著提高基因的翻譯效率，在腫瘤治療方面發(fā)揮重要作用，是未來 mRNA 藥物重要的發(fā)展方向。此外編碼前后的非轉(zhuǎn)譯區(qū)（UTR）負(fù)責(zé)調(diào)控轉(zhuǎn)譯及蛋白表達(dá)，對mRNA的轉(zhuǎn)譯效率、半衰期和最高表達(dá)水平等有顯著影響。同時(shí)，UTR中的GC水平、U水平均會影響mRNA的免疫原性，對疫苗的安全性和能否正常產(chǎn)生抗原造成影響。

圖 3. mRNA 技術(shù)的四大核心元素

遞送技術(shù)

mRNA 分子量大、親水性強(qiáng)，但自身的單鏈結(jié)構(gòu)致使其極為不穩(wěn)定，易被降解，自身攜帶負(fù)電荷，穿過表面同為負(fù)電荷的細(xì)胞膜遞送亦是難題，所以需要特殊的修飾或包裹遞送系統(tǒng)才能實(shí)現(xiàn) mRNA 的胞內(nèi)表達(dá)，改變 mRNA 胞內(nèi)的生物分布、細(xì)胞靶向和攝取機(jī)制，促進(jìn) mRNA 的遞送，發(fā)揮疫苗的效果，因此遞送技術(shù)也成為各家 mRNA 公司的核心專利技術(shù)。

目前最常用的 mRNA 疫苗遞送手段是脂質(zhì)納米粒（Lipidnanoparticle，LNP），Moderna 和 BioNTech 均采用此項(xiàng)技術(shù)，此外還有陽離子脂質(zhì)復(fù)合物 (lipoplex，LPX)、脂質(zhì)多聚復(fù)合物 (lipopolyplex，LPP)、聚合物納米顆粒（Polymer nanoparticles，PNP）、無機(jī)納米顆粒（Inorganic nanoparticles，INP）陽離子納米乳 (Cationic nanoemulsion，CNE)，瑞博生物還自主開發(fā)了 GalNac N-乙酰半乳糖胺技術(shù)，能夠進(jìn)行肝臟的定點(diǎn)傳遞。

圖 4. 目前主要LNP技術(shù)的專利格局

生產(chǎn)平臺搭建

生產(chǎn)是整個(gè) mRNA 藥物研發(fā)最后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，除了無核苷酸酶的生產(chǎn)環(huán)境投入巨大以外，工藝的開發(fā)同樣具有挑戰(zhàn)。第一步是編碼抗原的 DNA 模板生產(chǎn)，除了常用的大腸桿菌大規(guī)模體內(nèi)表達(dá)；第二步則是在無細(xì)胞的反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，通過 T7、SP6 或 T3 等 RNA 多聚酶作用，通過一步或者兩步法轉(zhuǎn)錄成為 mRNA，同時(shí)加上 5’ 的 Cap 及 3’ 的 Poly A 尾巴，在進(jìn)一步使用 DNA 酶將殘留的 DNA 模板進(jìn)行消除；隨后使用離子交換等層析步驟進(jìn)一步將轉(zhuǎn)錄形成的 mRNA 進(jìn)行純化，進(jìn)行超濾濃縮形成原液；制劑階段，通過微流體泵精確地控制著 mRNA 原液和脂質(zhì)流速，將他們混合成脂質(zhì)納米粒 LNP。最后則是成品的灌裝及質(zhì)量控制，貼簽形成終產(chǎn)品。

圖 5. mRNA 藥物的生產(chǎn)流程

隨著 mRNA 技術(shù)的廣泛應(yīng)用，mRNA 的生產(chǎn)技術(shù)也在快速發(fā)展，針對 mRNA 層析技術(shù)方案也在不斷優(yōu)化，特別是對于 mRNA 在治療領(lǐng)域應(yīng)用過程中，其純度控制對于療效至關(guān)重要。

參考文獻(xiàn)

1. mRNA vaccines manufacturing: Challenges and bottlenecks

2. An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development