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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2021-08-16 19:10
蛋白多肽類和單抗藥物免疫原性評(píng)價(jià)主要包括判定ADA 的存在與否、ADA 水平（抗體滴度）、是否具有中和能力、抗體產(chǎn)生比例和發(fā)展變化情況等。有多種方法和技術(shù)可用于 ADA 檢測(cè)。蛋白多肽類和單抗藥物由于給藥劑量大、半衰期長(zhǎng)，循環(huán)中的高濃度藥物給免疫原性的評(píng)估帶來了很大挑戰(zhàn)。另外，可溶性靶標(biāo)的存在也會(huì)給單抗藥物免疫原性檢測(cè)帶來較大干擾。如何減少這些干擾，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性和可靠性是當(dāng)前 ADA 和 NAb檢測(cè)方法亟需解決的問題。本文對(duì)常用的 ADA 和 NAb 檢測(cè)方法、檢測(cè)中存在的問題、已有解決方法及其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為蛋白多肽類藥物和單抗藥物研究開發(fā)和應(yīng)用中免疫原性的評(píng)價(jià)提供方法參考。
1 ADA 的檢測(cè)
ADA 的檢測(cè)和表征常采用多層次方法。檢測(cè)通常包括篩選試驗(yàn)和特異性確證試驗(yàn)；表征試驗(yàn)一般包括抗體滴度測(cè)定、亞型測(cè)定和中和抗體檢測(cè)。
凍干制劑關(guān)鍵技術(shù): 處方工藝研究、工藝放大與驗(yàn)證及案例分析
ADA 檢測(cè)試驗(yàn)需要兩個(gè)關(guān)鍵的決策參數(shù)，分別為篩選臨界點(diǎn)和特異性臨界點(diǎn)[2]。篩選臨界點(diǎn)即篩選試驗(yàn)中判斷樣品為陰性或陽性的響應(yīng)水平[3]，等于或高于篩選臨界點(diǎn)的樣品為陽性樣品。相反地，若低于篩選臨界點(diǎn)，則判斷該樣品為陰性樣品。一個(gè)有效的篩選臨界點(diǎn)需要在預(yù)研究驗(yàn)證階段對(duì)一系列樣品測(cè)定值進(jìn)行系統(tǒng)性的統(tǒng)計(jì)分析，然后才能確定。一般情況下，一定比例的假陽性結(jié)果比沒有假陽性結(jié)果好，可以允許約 5% 的篩選試驗(yàn)陽性結(jié)果為假陽性，以保證可以檢測(cè)出弱陽性樣品。同時(shí)，要求所使用的樣品可代表使用目標(biāo)群體或受試者。特異性臨界點(diǎn)是可以區(qū)別抗藥抗體與藥物是否特異性結(jié)合的值，其有效性非常關(guān)鍵，必須客觀評(píng)估。不建議使用 50% 信號(hào)抑制等主觀標(biāo)準(zhǔn)，信號(hào)略高于臨界點(diǎn)的抗藥抗體弱陽性樣品的評(píng)價(jià)尤為重要。
抗藥抗體的表征試驗(yàn)中抗體滴度的測(cè)定，一般表示為，能夠產(chǎn)生陽性結(jié)果的最低濃度，或者說最大稀釋倍數(shù)；亞型測(cè)定即檢測(cè)抗藥抗體所屬 IgA、IgD、IgE、IgG 以及 IgM 中的哪一種亞型；中和抗體的檢測(cè)即為檢測(cè) ADA 中是否有可以中和藥物活性的抗體。
1.1 ADA 檢測(cè)分析方法
1.1.1 ADA 檢測(cè)常用分析方法
常用方法包括酶聯(lián)免疫法（ELISA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、表面等離子體共振法（SPR）、電化學(xué)發(fā)光法（ECL）、全自動(dòng)納升級(jí)免疫分析工作站（Gyrolab）等。
免疫原性篩選通常使用操作方便快捷、能夠高通量測(cè)定的 ELISA 方法。橋式 ELISA 方法最為常用，該方法是利用包被在酶標(biāo)板上的抗體藥物捕獲血清樣品中的 ADA，然后加入生物素標(biāo)記的抗體藥物，使其與 ADA 結(jié)合。接著用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)試劑作為檢測(cè)試劑，加入酶反應(yīng)底物顯色后，再利用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。此法的優(yōu)點(diǎn)是能檢測(cè)各類抗體的亞型，可高通量檢測(cè)。但此法不易檢測(cè)到低親和力的抗體，在包被或標(biāo)記藥物時(shí)可能會(huì)掩蓋或者改變藥物的抗原表位，而且檢測(cè)時(shí)也容易受到藥物本身的干擾[4-5]。
RIPA 法是以放射性標(biāo)記的抗原或抗體通過免疫沉淀檢測(cè) ADA。優(yōu)點(diǎn)是中等或高通量水平，通常靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、樣品及試劑用量少。但缺點(diǎn)是該方法中標(biāo)記抗原的比活度和放化純度必須足夠高，而且所使用放射性同位素的半衰期也必須足夠長(zhǎng)，否則有部分抗體無法被檢測(cè)到，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。而且同位素具有潛在放射性危害，同位素標(biāo)記還會(huì)影響表位的暴露，標(biāo)記藥物非特異性地夾帶在沉淀物中，相對(duì)于固相表面，結(jié)合力較弱。
SPR 技術(shù)是將藥物偶聯(lián)在傳感器芯片上，其可與樣品中的抗藥抗體結(jié)合[6]，使傳感器能夠間接檢測(cè)到抗藥抗體，最后通過系統(tǒng)擬合的結(jié)合曲線對(duì) ADA 進(jìn)行定量分析。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、無標(biāo)記檢測(cè)，而且快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便，能檢測(cè)到不同親和力的抗體和各抗體亞型；缺點(diǎn)是所用試劑通用性差，通量低。
ECL 是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用磁珠或者石墨電極板作為反應(yīng)載體。將生物素標(biāo)記的藥物與鏈霉親和素包被的微磁珠或石墨電極板相結(jié)合，利用該藥物去捕獲樣品中的 ADA，然后再加入釕標(biāo)記的藥物，使其與 ADA 結(jié)合。形成免疫復(fù)合物后，以磁珠為載體的試驗(yàn)利用磁場(chǎng)吸附磁珠，并用 ProCell（在免疫分析系統(tǒng)中產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)的系統(tǒng)溶液）溶液將結(jié)合了磁珠的免疫復(fù)合物與未結(jié)合的組分分離，最后施加電壓?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，激發(fā)釕發(fā)出光信號(hào)，通過采集光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)化成ADA 濃度，得以實(shí)現(xiàn)對(duì) ADA 的定量。而以石墨電極板作為反應(yīng)載體的試驗(yàn)，將電極表面通電后，通過電化學(xué)作用激發(fā)釕標(biāo)記物發(fā)出強(qiáng)光，同樣通過檢測(cè)光信號(hào)進(jìn)行 ADA 的定量[7]。ECL 法精密度高、靈敏度高、線性范圍寬、檢測(cè)時(shí)間短、反應(yīng)體系可控、樣品用量少、通量高，缺點(diǎn)是需制備 2 種標(biāo)記物（生物素標(biāo)記的藥物和釕標(biāo)記的藥物），需要保證標(biāo)記物足夠穩(wěn)定，所用試劑通用性差。
使用 Gyrolab 平臺(tái)進(jìn)行免疫原性檢測(cè)，采用自動(dòng)化進(jìn)樣方式，將傳統(tǒng)的雙抗夾心大分子檢測(cè)方法與微流控 CD技術(shù)結(jié)合在一起，CD 微結(jié)構(gòu)中裝有鏈霉親和素包裹的微珠填料，通過生物素捕捉試劑，與樣本特異性相結(jié)合，再與帶熒光團(tuán)的檢測(cè)試劑結(jié)合，用工作站中的激光激發(fā)熒光，并用檢測(cè)器對(duì)吸附在樣本上的熒光標(biāo)記物進(jìn)行讀數(shù)。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于生物分析中的配體結(jié)合試驗(yàn)[8]。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化、通量高、節(jié)省時(shí)間、試劑盒樣品用量少、檢測(cè)范圍廣、基質(zhì)效應(yīng)低。專用的 Gyrolab ADA 軟件還可以幫助確定篩選臨界點(diǎn)和確證臨界點(diǎn)。
1.1.2 ADA 檢測(cè)新興分析技術(shù)
為滿足越來越嚴(yán)格的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的要求，涌現(xiàn)出一些新興 ADA 檢測(cè)分析技術(shù)。
免疫 PCR 法（Im-PCR），首先將 ADA 與固相上的藥物及生物素化藥物結(jié)合，從而形成“藥物-ADA-生物素化藥物”的橋梁，然后加入抗生物素-DNA 復(fù)合物作為檢測(cè)試劑，通過擴(kuò)增 DNA，間接對(duì) ADA 進(jìn)行檢測(cè)[9-10]。該方法也是在 ELISA 的基礎(chǔ)上建立起的，用 PCR 擴(kuò)增代替ELISA 的酶催化底物顯色[11]。PCR 具有很強(qiáng)的放大能力，可以檢測(cè)稀釋后的 ADA，不僅可減少基質(zhì)效應(yīng)，還具有非常高的靈敏度和特異性。與對(duì)應(yīng)的 ELISA 比較，Im-PCR可使 ADA 檢測(cè)的靈敏度提高約 1000 倍，而且本法中僅僅采用稀釋的方法就可以消除生物樣品中基質(zhì)的干擾[11]。
Singulex Erenna 是基于單分子檢測(cè)技術(shù)（SMC）的免疫檢測(cè)系統(tǒng)，原理與傳統(tǒng)的 ELISA 很相似，只是在捕獲和檢測(cè)步驟，藥物將每個(gè) ADA 轉(zhuǎn)化成信號(hào)。在洗脫步驟，熒光素標(biāo)記的檢測(cè)抗體從免疫復(fù)合物中解離下來，洗脫物被送入 Erenna 系統(tǒng)的毛細(xì)管中，毛細(xì)管上有一個(gè)非常微小的檢測(cè)空間可供激光照射。通過檢測(cè)空間時(shí)，單個(gè)的熒光素標(biāo)記抗體可以產(chǎn)生熒光閃爍，從而被檢測(cè)到。SMC 技術(shù)在獲得最優(yōu)化的免疫檢測(cè)效力的同時(shí)，操作流程相對(duì)更為簡(jiǎn)便，該技術(shù)通過整合獨(dú)特的洗脫步驟和靈敏的數(shù)字化檢測(cè)，相較于傳統(tǒng)免疫檢測(cè)技術(shù)，信噪比有了很顯著的改善，實(shí)現(xiàn)了可以在一個(gè)系統(tǒng)里同時(shí)檢測(cè)低水平和高水平的 ADA。
SQI SquidLite 技術(shù)可以在活化的玻璃表面上打印藥物的微陣列斑點(diǎn)[12]，加入待測(cè)樣品后，ADA 就會(huì)與藥物結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合 ADA，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度對(duì)ADA 進(jìn)行分析。該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了在同一孔中進(jìn)行 ADA 及其亞型的檢測(cè)，可以避免多次檢測(cè)帶來的樣本量的損耗。該技術(shù)與 ELISA 或 ECL 相比，有更高的敏感性和耐藥性。它的主要優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在，當(dāng)需要進(jìn)行檢測(cè)抗體分型時(shí)能夠多路復(fù)用，自動(dòng)化系統(tǒng)還具有高通量特性。然而該平臺(tái)使用專用緩沖器，前期需要大量成本。
Genalyte Maverick 系統(tǒng)也可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè) ADA 及其亞型。該技術(shù)平臺(tái)，將藥物捕獲探針印刷在硅光子生物傳感器表面，樣品中的 ADA 會(huì)被藥物捕獲，使用結(jié)合在鏈霉親和素包被珠上的生物素化藥進(jìn)行檢測(cè)，由于珠子的加入改變了原樣品溶液的折射率，然后根據(jù)折射率的變化，就可以測(cè)定 ADA[8]。該系統(tǒng)能夠檢測(cè)所有免疫球蛋白亞型，包括單價(jià)的 IgG4。然而該平臺(tái)要求樣品進(jìn)行酸解離預(yù)處理，然后用包被在 96 孔板上的藥物親和捕獲 ADA，ADA 要在低 pH 下洗脫和中和。SQI SquidLite 技術(shù)和 GenalyteMaverick 系統(tǒng)均有可自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)，但是后者不需要標(biāo)記，而且可以進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)讀取結(jié)果，而前者只有最終的結(jié)果讀數(shù)，并且目前使用較少。
1.2 ADA 檢測(cè)中主要干擾因素及解決方法
1.2.1 樣品基質(zhì)中循環(huán)藥物的干擾及解決方法
免疫原性檢測(cè)，會(huì)受到樣品基質(zhì)中循環(huán)藥物的干擾，過量的藥物與ADA 結(jié)合，會(huì)造成 ADA 檢測(cè)假陰性結(jié)果。目前 ADA 分析中有多種方法來提高藥物耐受性，減少或避免由于游離藥物的存在造成的假陰性結(jié)果，防止對(duì) ADA 的低估。
由于 ADA 在樣品中會(huì)有兩種存在形式，即游離 ADA和 ADA-藥物復(fù)合物[13]。游離的 ADA 相對(duì)比較容易檢測(cè)到，想要同時(shí)檢測(cè)與藥物結(jié)合的 ADA，單獨(dú)利用上述某一種方法或技術(shù)平臺(tái)難以實(shí)現(xiàn)。為了克服 ADA 檢測(cè)過程中受到的各種干擾，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，目前主要的預(yù)處理方法有吸附小柱去除游離藥物、酸解離或堿解離（絕大多數(shù)情況下為酸解離）、磁珠提取和酸解離（BEAD）、固相提取和酸解離（SPEAD）等方法。
1.2.1.1 吸附小柱去除游離藥物
吸附小柱可與藥物特異性結(jié)合的物質(zhì)（抗人 IgG 單克隆抗體或多克隆抗體）與固相載體（瓊脂糖樹脂、磁性顆粒、芯片或微流體）偶聯(lián)，該物質(zhì)不與樣品中除游離藥物之外的其他成分反應(yīng)，可特異性地結(jié)合待測(cè)樣品中的游離藥物，可以使其后的 ADA 檢測(cè)中（如使用橋接 ELISA 法）避免游離藥物與標(biāo)記試劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合待檢測(cè)的 ADA 所致的干擾，包括對(duì) ADA 檢測(cè)的低估或假陰性結(jié)果[14]。這個(gè)方法不僅有效地減少了藥物對(duì)抗藥抗體檢測(cè)的干擾，同時(shí)還提高了檢測(cè)靈敏度。但該方法只是去除樣品中游離的藥物，而已經(jīng)與 ADA 結(jié)合的藥物難以去除，藥物-ADA 復(fù)合物依舊會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。
1.2.1.2 酸解離
酸解離是較為常見的預(yù)處理手段[5]。具體地說，酸解離是通過酸化樣品來實(shí)現(xiàn)將 ADA-藥物復(fù)合物解離成 ADA 和藥物，但這僅是在酸性條件下的存在形式，酸化后的樣品需要在 pH 回到中性時(shí)方可被用于 ADA 的檢測(cè)。此時(shí)，樣品中的部分藥物和抗藥抗體又重新形成ADA-藥物復(fù)合物。而且，酸處理可以分解藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物，可能會(huì)將游離靶點(diǎn)釋放到樣品基質(zhì)中，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。但酸解離的最大目的是使得原來已與藥物結(jié)合的抗藥抗體至少有部分可以被檢測(cè)到，如果不采用酸解的話，可能檢測(cè)不到 ADA。在使用酸解離處理樣品的 ECL 檢測(cè)方法中，即使酸化后樣品中的抗藥抗體在中性 pH 條件下，僅僅只有部分會(huì)同時(shí)與電極板微孔中生物素化的藥物以及釕標(biāo)記的藥物結(jié)合，但仍然可被檢測(cè)出來。在所用酸解試劑不影響ADA 性質(zhì)的前提下，此方法簡(jiǎn)單，易操作。
1.2.1.3 BEAD 和 SPEAD
BEAD 法與 SPEAD 法原理相似，兩者均是在載體上包被鏈霉親和素以結(jié)合生物素-藥物偶聯(lián)物，差別在于 BEAD 法提取 ADA 的載體是磁珠，SPEAD 法提取 ADA 的載體是鏈霉親和素包被的石墨電極板或酶標(biāo)板[15-18]。在這兩種方法中，藥物-ADA 復(fù)合物在低 pH 條件下解離，當(dāng)溶液中和后，加入生物素-藥物偶聯(lián)物，與游離藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 ADA，生物素-藥物偶聯(lián)物與ADA 結(jié)合后被捕獲在鏈霉親和素包被的載體（磁珠或板）上。捕獲的 ADA 再次在低 pH 條件下處理洗脫，然后進(jìn)行檢測(cè)。相對(duì)而言，SPEAD 法具有操作簡(jiǎn)單和材料價(jià)格較低的優(yōu)勢(shì)，但與磁珠相比，板的結(jié)合能力相對(duì)較低。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，同樣條件下，BEAD 法得到的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，易重復(fù)。
1.2.1.4 沉淀和酸解離
Zoghbi 等[19]開發(fā)了一種突破性的新方法，即采用沉淀和酸解離（PandA）相結(jié)合的方法來克服 ADA 檢測(cè)中的藥物干擾。該方法的原理是將過量的藥物添加到含 ADA 的血清樣品中并孵育，以形成 ADA-藥物復(fù)合物。初次孵育后，在樣品中添加 PEG 并孵育以使復(fù)合物沉淀。對(duì)沉淀進(jìn)行一系列洗滌，最后一次洗滌后，將沉淀用乙酸解離，使 ADA-藥物復(fù)合物解離成 ADA 和藥物，并直接包被到石墨電極板上。孵育后，將板封閉，然后加入釕標(biāo)記的藥物與包被的 ADA 結(jié)合，通過 ECL 方法對(duì)ADA 進(jìn)行檢測(cè)。在他們的方法中，分別使用了人源化IgG1、全人源 IgG4 和人源化 IgG4 單抗藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均證明了該方法的適用性。然而本實(shí)驗(yàn)室在實(shí)際應(yīng)用該方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于操作步驟較多，分離沉淀和上清液難度也較大，而 PEG 的濃度也會(huì)影響靈敏度和特異性，因此不確定因素較多，導(dǎo)致重復(fù)性較差。
1.2.2 基質(zhì)中可溶性靶標(biāo)的干擾及解決方法
對(duì)于單抗藥物，可溶性靶標(biāo)的干擾也是一個(gè)特別具有挑戰(zhàn)性的問題。可溶性的二聚體或多聚體藥物靶標(biāo)可以在兩個(gè)標(biāo)記藥物分子之間形成橋梁，容易導(dǎo)致 ADA 假陽性結(jié)果。
單克隆抗體藥物 ADA 檢測(cè)中，對(duì)于可溶性靶標(biāo)的干擾問題，目前通常采用的解決方法是將基質(zhì)中的可溶性靶點(diǎn)進(jìn)行清除，通?？梢杂冒悬c(diǎn)抑制劑（一般為相應(yīng)的抗靶點(diǎn)抗體）去結(jié)合靶點(diǎn)，可去除靶點(diǎn)的干擾作用，提高靶點(diǎn)耐受性[20]。
1.2.3 基質(zhì)中類風(fēng)濕因子的干擾及解決辦法
類風(fēng)濕因子（RF）是以變性的 IgG 的 Fc 片段為靶抗原的自身抗體，RF 不僅可與變性的 IgG 結(jié)合，也與自身 IgG 或異體 IgG反應(yīng)，常對(duì)免疫檢測(cè)造成干擾。在檢測(cè) ADA 時(shí)，如果用的捕獲抗體和檢測(cè)抗體均為 IgG，樣本基質(zhì)中的 RF 能同時(shí)與二者結(jié)合，形成捕獲抗體-RF-檢測(cè)抗體復(fù)合物，從而產(chǎn)生 ADA 假陽性。而當(dāng) RF 只能與其中一種抗體結(jié)合時(shí)，又會(huì)造成空間位阻，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。對(duì)于存在 RF干擾的樣本，可通過對(duì)樣本進(jìn)行前處理以消除或盡可能降低其干擾。常用的方法包括：分析前在樣本中加入動(dòng)物血清或IgG，或加入封閉阻斷試劑；用包被 IgG 的固體顆粒吸附；使用阻斷試管采集樣本等[21]。
前文所述的檢測(cè)方法和平臺(tái)多數(shù)都較為傳統(tǒng)，通常都是在前處理過程中將 ADA-藥物復(fù)合物分開，然后單獨(dú)檢測(cè)ADA。是否可以實(shí)現(xiàn)在 ADA-藥物復(fù)合物不分開的情況下檢測(cè) ADA，值得進(jìn)一步探究。
2 NAb 的檢測(cè)
藥物的中和抗體指能夠中和藥物活性的抗藥抗體，單抗藥物的中和抗體是與單抗互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）特異性結(jié)合的抗藥抗體[22]。在某些情況下，NAb 還可以與內(nèi)源性對(duì)應(yīng)物發(fā)生交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致一些正常生理功能受損和危及生命的副作用。因此 NAb 的表征已經(jīng)成為評(píng)估生物技術(shù)藥物安全性和有效性的重要要素。
2.1 NAb 檢測(cè)方法
NAb 檢測(cè)通常分為兩類：基于細(xì)胞的分析檢測(cè)（CBA）和競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合分析檢測(cè)（CLBA）[23]。CBA 方法使用表達(dá)藥物預(yù)定靶點(diǎn)的細(xì)胞，樣品中的 NAb 阻止了藥物與其靶點(diǎn)結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)胞效應(yīng)，從而根據(jù)細(xì)胞效應(yīng)減弱的程度進(jìn)行 NAb 分析；CLBA 方法是通過評(píng)價(jià)可溶性靶點(diǎn)和樣品中NAb 對(duì)藥物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，再結(jié)合 ELISA 或 ECL 平臺(tái)進(jìn)行 NAb 檢測(cè)。
對(duì)于 NAb 檢測(cè)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)推薦基于細(xì)胞的分析檢測(cè)作為首選方法，因?yàn)榧?xì)胞反應(yīng)更能反映 NAb 在體內(nèi)對(duì)藥物的影響[3]?？贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）是一種常見的治療性抗體藥物的作用機(jī)制。Wu 等[23]建立、優(yōu)化了一種基于 ADCC 的 NAb 檢測(cè)方法，用該方法來檢測(cè)貝那利珠單抗給予人后誘導(dǎo)的 NAb。其原理是貝那珠單抗與靶細(xì)胞上的人 IL-5R 結(jié)合，并且貝那珠單抗的 Fc 區(qū)通過CD16 與效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合，從而誘導(dǎo)靶細(xì)胞的 ADCC。ADCC活性與熒光素酶報(bào)告基因的激活密切相關(guān)。在含有 NAb 的血清樣品中，ADCC 就會(huì)被 NAb 抑制，導(dǎo)致熒光素酶信號(hào)（RLU 值）降低。產(chǎn)生的熒光素酶信號(hào)與樣品中存在的NAb 數(shù)量成反比。雖然該方法藥物耐受性和靈敏度都不是很高，但用于檢測(cè)臨床樣本是可行的。
美國(guó)瑞澤恩制藥公司發(fā)明了用于檢測(cè)中和抗體的競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合法[24]，該方法簡(jiǎn)單來說包括以下步驟，首先要獲取樣品，然后在捕獲試劑（一般為生物素標(biāo)記的治療性蛋白藥物）存在下孵育樣品，最后加入檢測(cè)試劑。其中相對(duì)于對(duì)照樣品降低的信號(hào)指示針對(duì)蛋白多肽或單抗藥物的中和抗體存在。該方法靈敏度較高，特異性較強(qiáng)，動(dòng)態(tài)范圍較廣，檢測(cè)時(shí)間較短，有相對(duì)更高的藥物耐受性。
Wu 等[23]曾通過檢測(cè)貝那利珠單抗的中和抗體對(duì)比了CBA 與 CLBA 兩種方法在檢測(cè) NAb 時(shí)精密度、靈敏度以及藥物耐受性等方面的差異。CLBA 與 CBA 批內(nèi)變異相當(dāng)，與 CBA 相比，CLBA 批間變異相對(duì)小得多，因此CLBA 比 CBA 精密度更高。CLBA 對(duì)單克隆 ADA 陽性對(duì)照及多克隆 ADA 陽性對(duì)照的檢測(cè)靈敏度也相對(duì)較高。另外，盡管兩種方法的藥物耐受性都是有限的，但 CLBA藥物耐受性約為 2.5 倍（可檢測(cè)到的 NAb 濃度與藥物濃度比），而 CBA 則只有 1.6 倍，因此 CLBA 藥物耐受性同樣相對(duì)較高。Hu 等[25]在 3 項(xiàng)臨床研究中也進(jìn)行了 CBA和 CLBA 法的對(duì)比，其中兩項(xiàng)研究結(jié)果表明 CBA 和CLBA 檢測(cè)中和抗體的能力相當(dāng)，在第三項(xiàng)研究中，CLBA表現(xiàn)相對(duì)較差。由此可見，無論是 CBA 還是 CLBA，都有自身的優(yōu)勢(shì)和局限性，應(yīng)根據(jù)每一種藥物獨(dú)特的作用機(jī)制、免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及技術(shù)可行性評(píng)估去選擇和設(shè)計(jì) NAb檢測(cè)方法。
2.2 NAb 檢測(cè)中常見的干擾因素及解決辦法
在 CBA 分析中，同樣存在著樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾，樣本基質(zhì)中高濃度的循環(huán)藥物可與 NAb 結(jié)合，并導(dǎo)致假陰性結(jié)果；樣品基質(zhì)中的可溶性靶點(diǎn)與藥物結(jié)合，阻止了藥物介導(dǎo)的細(xì)胞依賴的生物活性作用，導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性結(jié)果。而在 CLBA 分析中，游離的可溶性靶標(biāo)可以阻止標(biāo)記的靶標(biāo)與檢測(cè)板上包被的藥物結(jié)合，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。
為了避免假性結(jié)果的出現(xiàn)，可采用各種方法來減輕循環(huán)藥物及可溶性靶點(diǎn)對(duì) NAb 分析的干擾。用于解決 ADA 檢測(cè)干擾問題的預(yù)處理方法同樣適用于 NAb 的檢測(cè)，例如酸解離、循環(huán)藥物的去除、從樣品基質(zhì)中分離 ADA 或使用抗靶點(diǎn)抗體抑制藥物靶點(diǎn)等，但有些方法的一些步驟需要進(jìn)行改進(jìn)，如 SPEAD 和 BEAD 方法，以更有利于 NAb 的檢測(cè)。
在 SPEAD 或 BEAD 中，在低 pH 下，鏈霉親和素包被的磁珠上結(jié)合的生物素-藥物結(jié)合物由于結(jié)合能力降低可能會(huì)發(fā)生一定程度的浸出，盡管通常來講生物素-藥物的浸出對(duì) ADA 分析沒有明顯影響，但浸出的生物素-藥物會(huì)與 NAb 結(jié)合，可能干擾 NAb 檢測(cè)，影響分析結(jié)果。可通過優(yōu)化所用洗脫溶液的 pH、生物素摩爾比以及孵育時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件，解決生物素-藥物結(jié)合物浸出問題[15]。
3 結(jié)語
在生物技術(shù)藥物的安全性和有效性的評(píng)估中，免疫原性一直是非常重要的評(píng)價(jià)內(nèi)容[26]，ADA 檢測(cè)方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化是免疫原性評(píng)價(jià)的一大問題[27]。高濃度循環(huán)藥物的干擾，是當(dāng)前 ADA 與 NAb 檢測(cè)面臨的主要問題。對(duì)于單抗藥物而言，可溶性靶標(biāo)也會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾，這些都會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。目前主要的方法是進(jìn)行酸解或磁珠提取等預(yù)處理，或者將不同預(yù)處理方法相結(jié)合。在研究中，應(yīng)該考慮每種藥物的特點(diǎn)、檢測(cè)目的、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、靈敏度目標(biāo)、操作難易程度及可行性等，選擇適用的分析方法和平臺(tái)。
近年來，不同的免疫原性分析方法在靈敏度和耐藥性方面有了大幅提高，并且在持續(xù)完善。隨著免疫原性評(píng)價(jià)技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信將有更加優(yōu)化的方法出現(xiàn)，用于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)蛋白多肽類和單抗藥物的免疫原性。
作者｜王慧敏，聞鎳，王曉霞，劉麗，劉會(huì)芳
內(nèi)容來源｜中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù) 2021.06
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