中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

前   言

 

遺傳毒性試驗(yàn)評(píng)估什么？

 

遺傳毒性試驗(yàn)是采用哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母菌、真菌或整體動(dòng)物測(cè)定試驗(yàn)樣品是否會(huì)引起基因突變，染色體結(jié)構(gòu)畸變以及其他DNA或基因變化的試驗(yàn)。

 

遺傳毒性試驗(yàn)主要用于檢測(cè)兩類主要的遺傳損傷，一類是基因突變（點(diǎn)突變）；另一類是染色體損傷評(píng)價(jià)，例如染色體結(jié)構(gòu)畸變，染色體缺失和插入，染色體數(shù)目畸變。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，體外哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)和體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)得到一致的結(jié)果，但這兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果一致認(rèn)為有遺傳毒性的化合物在細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中卻產(chǎn)生陰性的結(jié)果。該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果表明，單一的試驗(yàn)無(wú)法檢測(cè)出所有相關(guān)遺傳物質(zhì)，因此通常進(jìn)行一組體外試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)的遺傳毒性試驗(yàn)組合中，體外哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)和體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)中任何一個(gè)與細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)組合，當(dāng)前監(jiān)管機(jī)構(gòu)都認(rèn)為是可以接受的。

 

哪些醫(yī)療器械需要進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)？

 

 

體外遺傳毒性試驗(yàn)常用的為細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，體外哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)和體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞TK試驗(yàn)。接下來(lái)將一一介紹。

 

染色體畸變?cè)囼?yàn)簡(jiǎn)介

 

試驗(yàn)?zāi)康暮驮?/span>

 

通過(guò)檢測(cè)受試物是否誘發(fā)體外培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞染色體畸變，評(píng)價(jià)受試物致突變的可能性。在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞暴露于受試物中。用中期分裂阻斷劑（如秋水仙素）處理，使細(xì)胞停止在中期分裂相，隨后收獲細(xì)胞、制片、染色、分析染色體的畸變。

 

染色體畸變?cè)囼?yàn)測(cè)試方法

 

預(yù)實(shí)驗(yàn)

 

對(duì)懷疑有細(xì)胞毒性反應(yīng)的試驗(yàn)樣品應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。宜在有或無(wú)代謝活化的情況下，使用相對(duì)群體倍增數(shù)（RPD）或者相對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)（RICC）來(lái)評(píng)估樣品的細(xì)胞毒性，以保證有足夠數(shù)目的細(xì)胞處于有絲分裂狀態(tài)。

 

當(dāng)試驗(yàn)樣品具有細(xì)胞毒性時(shí)，應(yīng)以試驗(yàn)樣品或浸提原液作為最高濃度組進(jìn)行稀釋，即實(shí)驗(yàn)用最高濃度與陰性對(duì)照相比RPD或RICC達(dá)到（55±5）%的濃度。測(cè)試一般選用3個(gè)測(cè)試濃度。

 

正試驗(yàn)

 

試驗(yàn)分為短期處理組（有和無(wú)代謝活化系統(tǒng)）和長(zhǎng)期處理組（無(wú)代謝活化系統(tǒng)）。短期處理組是使用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞與試驗(yàn)樣品、對(duì)照樣品分別在有代謝活化系統(tǒng)和無(wú)代謝活化系統(tǒng)的情況下接觸處理3-6小時(shí)，接觸后使用PBS清洗細(xì)胞3次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并在接觸開始后約1.5倍細(xì)胞正常周期時(shí)收獲細(xì)胞。長(zhǎng)期處理組是使用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞與試驗(yàn)樣品、對(duì)照樣品在無(wú)代謝活化系統(tǒng)的情況下接觸處理約1.5倍細(xì)胞正常周期，然后收獲細(xì)胞。收獲細(xì)胞前1-3小時(shí)加入細(xì)胞分裂中期阻斷劑秋水仙素，使其終濃度在0.1µg/ml~1µg/ml。收獲細(xì)胞時(shí)，先使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后將細(xì)胞放在氯化鉀溶液中進(jìn)行低滲，低滲的目的是使細(xì)胞充分膨脹，易于在滴片的時(shí)候破裂。低滲后的細(xì)胞使用固定液進(jìn)行反復(fù)固定，然后滴片、染色并觀察。一般每組至少評(píng)估300個(gè)處于中期分裂的細(xì)胞，記錄染色體畸變的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算染色體畸變率。

 

染色體畸變?cè)囼?yàn)接受標(biāo)準(zhǔn)

 

質(zhì)控接受標(biāo)準(zhǔn)：

 

a）陰性對(duì)照應(yīng)在歷史陰性對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)95%的控制限值范圍內(nèi)；

 

b）陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)在歷史陽(yáng)性對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)95%的控制限制范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照相比應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加。

 

陽(yáng)性結(jié)果：

 

滿足質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)下，試驗(yàn)成立，若出現(xiàn)下列情況可判定試驗(yàn)樣品呈陽(yáng)性：

 

a）與陰性對(duì)照相比，染色體結(jié)構(gòu)畸變率在統(tǒng)計(jì)上顯著地增加；

 

b）如存在多劑量組試驗(yàn)時(shí)，當(dāng)用適當(dāng)?shù)臐舛忍荻葴y(cè)試進(jìn)行評(píng)估時(shí)存在與劑量相關(guān)的增加；

 

c）任一組結(jié)果超出了歷史的陰性對(duì)照數(shù)據(jù)的分布范圍（例如，95%的控制限值）。

 

當(dāng)滿足上述所有這些標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，認(rèn)為試驗(yàn)樣品在本試驗(yàn)系統(tǒng)下具有致哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變性。

 

體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)簡(jiǎn)介

 

什么是體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)

 

體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)是一種哺乳動(dòng)物體細(xì)胞基因正向突變實(shí)驗(yàn)，近年來(lái)其應(yīng)用價(jià)值有明顯的提高。TK基因突變的檢測(cè)終點(diǎn)是胸苷激酶（TK）基因的突變。人類TK基因定位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端；小鼠定位于11號(hào)染色體。TK基因突變屬于常染色體基因突變。

 

體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)的目的及原理

 

TK基因突變的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷（TdR）生成胸苷酸(TMP)的反應(yīng)。在正常情況下，此反應(yīng)并非生命所必須，原因是體內(nèi)TMP主要來(lái)自于脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應(yīng)生成TMP。但如果在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入胸苷類似物（如三氟胸苷，即trifluorothymidine，TFT）,則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進(jìn)而摻入DNA,造成致死性突變，故細(xì)胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變，導(dǎo)致胸苷激酶缺陷，則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA，故細(xì)胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，即表現(xiàn)出對(duì)TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù)，可計(jì)算突變頻率，從而推斷受試物的致突變性。

 

細(xì)胞系的選擇

 

標(biāo)準(zhǔn)推薦選用L5178Y TK+/--3.7.2C細(xì)胞系。當(dāng)試驗(yàn)細(xì)胞系平均自發(fā)突變頻率超出50×10-6~170×10-6范圍時(shí)，需要對(duì)自發(fā)突變細(xì)胞進(jìn)行清除。使用THMG培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，200g離心5min，再用THG培養(yǎng)2天。

 

體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)的檢測(cè)方法

 

預(yù)實(shí)驗(yàn)：

 

當(dāng)懷疑試驗(yàn)樣品具有細(xì)胞毒性時(shí)，以試驗(yàn)樣品或浸提原液作為最高濃度組進(jìn)行梯度稀釋，最高的試驗(yàn)濃度應(yīng)為相對(duì)存活率在10%~20%的濃度，梯度稀釋宜包括從中到小或無(wú)細(xì)胞毒性的濃度范圍。

 

主試驗(yàn)：

 

與染色體畸變?cè)囼?yàn)相同，同樣分為短期處理組（有和無(wú)代謝活化系統(tǒng)）和長(zhǎng)期處理組（無(wú)代謝活化系統(tǒng)）。有活化系統(tǒng)與細(xì)胞懸液和試驗(yàn)樣品（浸提液）及S9混合液組成，無(wú)代謝活化系統(tǒng)由細(xì)胞懸液和試驗(yàn)樣品（浸提液）及PBS組成。然后將混合液置于37℃振蕩培養(yǎng)4h，后用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后用培養(yǎng)基重懸。部分用于接種平板，每種劑量?jī)蓧K平板，置于37℃培養(yǎng)10d~12d。部分繼續(xù)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)2天，然后接種平板，分為PE2平板接種與TFT平板接種，每種劑量同樣接種兩塊平板，置于37℃培養(yǎng)10d~12d。

 

體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

 

陰性對(duì)照組：平板效率為65%~120%，突變頻率MF應(yīng)為50×10-6~170×10-6；

 

陽(yáng)性對(duì)照組：至少滿足以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)則試驗(yàn)有效，否則應(yīng)重新試驗(yàn)：

 

1）陽(yáng)性對(duì)照MF與陰性對(duì)照有顯著性差異，比陰性對(duì)照高300×10-6以上，其中陽(yáng)性對(duì)照的小集落突變頻率應(yīng)占40%以上。

 

2）陽(yáng)性對(duì)照的小集落突變頻率比陰性對(duì)照高150×10-6以上。

 

體外小鼠淋巴瘤TK試驗(yàn)的結(jié)果判定

 

試驗(yàn)組MF與陰性對(duì)照組有顯著性差異，且超過(guò)GEF(126×10-6)以上并具有重現(xiàn)性，則可判定檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。

 

試驗(yàn)組MF與陰性對(duì)照組沒(méi)有顯著性增長(zhǎng)，或有增加但小于GEF(126×10-6)，則可判定檢測(cè)結(jié)果陰性。

 

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)簡(jiǎn)介

 

試驗(yàn)?zāi)康暮驮?/span>

 

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)是檢測(cè)受試物對(duì)于微生物（細(xì)菌）的基因突變作用，預(yù)測(cè)其潛在的遺傳毒性。

 

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)利用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變。這類菌株本身不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅有少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株會(huì)回復(fù)突變成野生型，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)形成菌落。故可以根據(jù)菌落形成的數(shù)量判斷受試樣品中是否存在致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，故需要同時(shí)在存在和沒(méi)有代謝活化協(xié)同的條件下進(jìn)行試驗(yàn)。

 

試驗(yàn)菌株

 

至少應(yīng)使用五種菌株。推薦使用以下菌種組合：

 

1) 鼠傷寒沙門氏菌TA1535；

 

2) 鼠傷寒沙門氏菌TA97a或TA97或TA1537；

 

3) 鼠傷寒沙門氏菌TA98；

 

4) 鼠傷寒沙門氏菌TA100；

 

5) 鼠傷寒沙門氏菌TA102或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA(PKM101)。

 

測(cè)試方法

 

預(yù)實(shí)驗(yàn)：

 

對(duì)未知或懷疑對(duì)試驗(yàn)菌株有抑制作用的試驗(yàn)樣品，應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。在有或無(wú)代謝活化的情況下，用回復(fù)突變的菌落數(shù)來(lái)評(píng)估樣品是否有細(xì)胞毒性，如有抑制作用，則需對(duì)試驗(yàn)樣品浸提液進(jìn)行梯度稀釋，所選的劑量范圍應(yīng)包括細(xì)胞毒性從最大到小或無(wú)細(xì)胞毒性，一般至少包括5個(gè)試驗(yàn)濃度梯度，并以最小或者無(wú)細(xì)胞毒性的濃度按照平板滲入法進(jìn)行主試驗(yàn)。

 

主試驗(yàn)（平板滲入法）：

 

使用移液器將冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基無(wú)菌試管內(nèi)，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-12h至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，其濃度不少于1×109CFU/ml，培養(yǎng)瓶可用黑紙包裹，以防光線照射細(xì)菌。

 

融化頂層培養(yǎng)基，將融化好的頂層培養(yǎng)基分裝于無(wú)菌小試管，每管2mL，將試管放入45℃恒溫水浴鍋中保溫。在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入每種菌株的新鮮菌液0.1mL混勻，試驗(yàn)樣品組加入浸提液0.1mL，陰性對(duì)照組加入0.1mL浸提介質(zhì)，陽(yáng)性對(duì)照組加入0.1mL誘變劑，活化組加入0.5mL10%S9混合液，未活化組加入0.5mL 0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液，每個(gè)組做3個(gè)平行，輕輕混勻后迅速將此混合物倒入已經(jīng)固化的底層培養(yǎng)基平皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使頂層培養(yǎng)基均勻分布，平放固化。全部平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48~72h。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)并記錄每個(gè)平皿的菌落數(shù)，并計(jì)算3個(gè)平皿的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

 

接受標(biāo)準(zhǔn)

 

質(zhì)控接受標(biāo)準(zhǔn)：

 

陰性對(duì)照組細(xì)菌回復(fù)突變數(shù)應(yīng)在自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)范圍內(nèi)；

 

陽(yáng)性對(duì)照組的菌落數(shù)應(yīng)與陰性對(duì)照組菌落數(shù)存在顯著性增加；否則對(duì)不在范圍內(nèi)的菌株應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。

 

結(jié)果判定：

 

至少有一個(gè)試驗(yàn)菌株，無(wú)論在+S9或-S9條件下，試驗(yàn)樣品組的細(xì)菌回復(fù)突變菌落數(shù)在一個(gè)或多個(gè)濃度條件下呈現(xiàn)可重復(fù)性的增長(zhǎng)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的為陽(yáng)性結(jié)果。

 

結(jié)果符合上述標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)物質(zhì)被認(rèn)為有致突變性。