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掃描隧道電子顯微鏡要求樣品表面能夠?qū)щ姡荒苤苯佑^察導(dǎo)體和半導(dǎo)體的表面結(jié)構(gòu)，對(duì)于非導(dǎo)電樣品則要在表面覆蓋一層導(dǎo)電薄膜，導(dǎo)電薄膜的粒度和均勻性難以保證，會(huì)掩蓋樣品表面的細(xì)節(jié)，為了彌補(bǔ)STM的這一不足，1986年Binning，Quate和Gerber發(fā)明了第一臺(tái)原子力顯微鏡AFM。

 

AFM的基本工作原理

 

圖1. AFM組成示意圖

 

 

原子力顯微鏡是將一個(gè)對(duì)微弱力極敏感的微懸臂一端固定，另一端有一微小的針尖，針尖與樣品表面輕輕接觸，由于針尖尖端原子與樣品表面原子間存在極微弱的作用力（斥力或者范德華力），通過掃描時(shí)控制這種力的恒定，帶有針尖的微懸臂將對(duì)應(yīng)于針尖與樣品表面原子間作用力的等位面而在垂直于樣品的表面方向起伏運(yùn)動(dòng)。利用光學(xué)檢測(cè)法和隧道電流檢測(cè)法，可以測(cè)得微懸臂對(duì)應(yīng)于掃描各點(diǎn)的位置變化，從而獲得樣品的表面形貌信息。

 

AFM操作模式

 

接觸式：

 

圖2. AFM接觸式探針與樣品示意圖

 

 

該方式所感知的力是接觸原子的外層電子相互排斥的庫倫力，這種相互排斥的庫倫力大小在10-8~10-11 N，該方式可以穩(wěn)定地獲得高分辨率樣品表面微觀形貌圖。缺點(diǎn)是檢測(cè)彈性模量低的軟質(zhì)樣品時(shí)，樣品表層在針尖里的作用下會(huì)產(chǎn)生變形，甚至劃傷；針尖和樣品接觸并滑行，容易使探針尖磨損甚至損壞。

 

非接觸式：

 

該模式下測(cè)量的作用力是以范德華力為主的吸引力，針尖-樣品間的距離大約5-20 nm。非接觸模式下針尖測(cè)量時(shí)不會(huì)使樣品表面變形，同時(shí)針尖也不易磨損，但是非接觸模式測(cè)量靈敏度要低些。

 

輕敲式：

 

圖3. AFM 輕敲式示意圖

 

 

該模式是用一個(gè)小壓電陶瓷元件驅(qū)動(dòng)微懸臂振動(dòng)，其振動(dòng)頻率恰好高于探針的最低機(jī)械共振頻率，探針能夠?qū)︱?qū)動(dòng)信號(hào)起放大作用，當(dāng)把這種受迫振動(dòng)的探針調(diào)節(jié)到樣品表面時(shí)，探針與樣品表面會(huì)產(chǎn)生微弱的吸引力，這種吸引力會(huì)使探針的共振頻率降低，驅(qū)動(dòng)頻率和共振頻率的產(chǎn)局增大，探針剪短振幅減少，用激光檢測(cè)出振幅的變化就可以推測(cè)出樣品表面的起伏。

該模式有效地克服了掃描過程中針尖劃傷樣品的缺點(diǎn)和針尖被拖過樣品而受到摩擦力等的影響。

 

相移模式：

 

圖4. 相移模式示意圖

 

 

作為輕敲模式的一項(xiàng)重要擴(kuò)展技術(shù)，相移模式是通過檢測(cè)驅(qū)動(dòng)微懸臂探針振動(dòng)的信號(hào)源的相位角與探針實(shí)際振動(dòng)的相位角之差的變化來成像。

 

AFM三大特點(diǎn)

 

原子級(jí)的高分辨率：

 

光學(xué)顯微鏡的放大倍數(shù)一般不超過1000倍，電子顯微鏡的放大倍數(shù)極限為100萬倍，而AFM的放大倍數(shù)能高達(dá)10億倍。

 

圖5. Au(001)表面濺射單晶的AFM圖像

 

 

觀察活的生命樣品：

 

電子顯微鏡的樣品必須進(jìn)行固定、脫水、切片等處理，只能觀察死的細(xì)胞或組織，因?yàn)樵恿︼@微鏡的樣本可以是各種物質(zhì)，在大氣條件或者溶液中都能進(jìn)行，可以觀察活的生命樣品及其動(dòng)態(tài)過程。

 

圖6. 癌細(xì)胞的AFM圖像

 

 

加工樣品的力行為：

 

除了能測(cè)試樣品的硬度和彈性等，AFM還能產(chǎn)生和測(cè)量電化學(xué)反應(yīng)，具有對(duì)標(biāo)本的分子或原子進(jìn)行加工的力行為，例如搬移原子，切割染色體等。

 

AFM應(yīng)用實(shí)例

 

1. 原子力顯微鏡研究小鼠生長(zhǎng)板軟骨增生區(qū)發(fā)育過程中的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能[1]

 

生長(zhǎng)板（growth plate, GP）是一種動(dòng)態(tài)組織，通過軟骨細(xì)胞增殖，肥大和基質(zhì)產(chǎn)生來驅(qū)動(dòng)骨骼伸長(zhǎng)。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）是GP生物力學(xué)特性的主要決定因素，并被認(rèn)為對(duì)軟骨細(xì)胞的幾何形狀和排列起關(guān)鍵作用，從而指導(dǎo)適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)板形態(tài)發(fā)生和骨伸長(zhǎng)。為了闡明軟骨形態(tài)發(fā)生過程中形態(tài)與生物力學(xué)之間的關(guān)系，本文通過AFM研究了小鼠從胚胎期到成年期GP增生區(qū)的年齡依賴性結(jié)構(gòu)和彈性特性。

 

圖7. 小鼠胚胎和發(fā)育階段的AFM圖像和ECM詳細(xì)圖像

 

 

圖8. 小鼠成熟階段的AFM圖像和ECM詳細(xì)圖像

 

 

從胚胎第13.5天到出生后第2周，細(xì)胞逐漸變平并排列成列，這與膠原蛋白密度和ECM硬度的增加有關(guān)，隨后從第2周到4個(gè)月，細(xì)胞形狀，膠原蛋白密度和ECM硬度幾乎恒定。而且發(fā)現(xiàn)在所有年齡段，柱內(nèi)基質(zhì)和柱間基質(zhì)之間的膠原網(wǎng)絡(luò)密度和組織結(jié)構(gòu)存在明顯差異，局部ECM剛度的差異可能會(huì)迫使細(xì)胞在細(xì)胞分裂后排列成柱狀結(jié)構(gòu)，并在胚胎和少年發(fā)育過程中驅(qū)動(dòng)骨骼伸長(zhǎng)。

 

2. 原子力顯微鏡探究瀝青的分子結(jié)構(gòu)[2]

 

在實(shí)際生活中，分子通常以混合物形式存在，石油是此類混合物中最主要的，也是現(xiàn)今人們遇到的最復(fù)雜的材料之一，其化學(xué)成分可能超過100,000中。原油的主要未分解成分是瀝青質(zhì)，了解瀝青質(zhì)的結(jié)構(gòu)具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和研究?jī)r(jià)值，是建立石油化學(xué)中結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的先決條件。但它們的分子結(jié)構(gòu)一直受到爭(zhēng)論：有研究認(rèn)為單個(gè)瀝青質(zhì)分子主要包含一個(gè)多環(huán)芳烴，而其他研究表明，具有多個(gè)多環(huán)芳烴的結(jié)構(gòu)也有貢獻(xiàn)。

本文結(jié)合掃描隧道顯微鏡STM和原子力顯微鏡AFM，進(jìn)行軌道成像探究瀝青質(zhì)的多環(huán)芳烴，得到了瀝青質(zhì)單個(gè)分子的原子分辨率低溫AFM圖，并結(jié)合AFM圖像進(jìn)行結(jié)構(gòu)假設(shè)，在對(duì)比度較弱的區(qū)域，經(jīng)拉普拉斯濾波的圖像能夠顯示其他細(xì)節(jié)，而LUMO和HOMO的軌道圖像則用于進(jìn)一步闡明分子結(jié)構(gòu)。

 

圖9. 煤衍生的瀝青質(zhì)的AFM圖像和STM圖像

 

 

 

圖10. 基于AFM測(cè)量和STM軌道圖像提出的瀝青質(zhì)結(jié)構(gòu)。X表示碳骨架內(nèi)的未知部分（可能是CH，CH2，N，NH，Om或S），R表示未知的側(cè)鏈基團(tuán)。

 

 

3. 原子力顯微鏡對(duì)水網(wǎng)絡(luò)的超高分辨率成像[3]

 

在金屬表面上生長(zhǎng)的水層中存在局部缺陷，且對(duì)表面的潤(rùn)濕過程有很大影響。但是，這種結(jié)構(gòu)是無法用宏觀方法檢測(cè)到的。本文通過使用非接觸AFM和分子功能化針尖，獲得了銅（110）表面上單水層的超高分辨率成像。

 

圖11. 五邊形水鏈末端的STM（頂部）和AFM（中間）圖像，末端的原子結(jié)構(gòu)疊加在經(jīng)過拉普拉斯濾波的AFM圖像上（底部）。

 

 

圖12. 六邊形水層可視化成像

 

 

AFM的尖端被一氧化碳終止，主要成像的是氧氣原子，氫原子的貢獻(xiàn)很小。AFM圖像中的氧氣骨架表明，包含局部缺陷和邊緣的水網(wǎng)絡(luò)由五邊形和六邊形環(huán)組成。本文展示了帶有功能化探針的AFM在金屬表面的水分子層可視化方面的應(yīng)用，包括其缺陷，邊緣和區(qū)域邊界，加強(qiáng)了原子力顯微鏡對(duì)表征弱鍵合分子組裝體原子結(jié)構(gòu)的適用性。

 

參考文獻(xiàn)

 

[1] C. Prein, N. Warmbold, Z. Farkas, M. Schieker, A. Aszodi, H. Clausen-Schaumann, Structural and mechanical properties of the proliferative zone of the developing murine growth plate cartilage assessed by atomic force microscopy, Matrix Biology, 50 (2016) 1-15.

[2] B. Schuler, G. Meyer, D. Peña, O.C. Mullins, L. Gross, Unraveling the molecular structures of asphaltenes by atomic force microscopy, Journal of the American Chemical Society, 137 (2015) 9870-9876.

[3] A. Shiotari, Y. Sugimoto, Ultrahigh-resolution imaging of water networks by atomic force microscopy, Nature Communications, 8 (2017) 14313.