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［摘要］ 治療性單克隆抗體( 單抗) 類(lèi)藥物是高度均一的生物大分子，抗原表位、理化性質(zhì)和生物活性等方面的均一性程度高，能夠通過(guò)特異性地與靶標(biāo)分子結(jié)合發(fā)揮治療作用。單抗類(lèi)藥物治療過(guò)程中不良反應(yīng)發(fā)生率低、患者耐受性高。單抗類(lèi)藥物是生物藥物領(lǐng)域的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)，已成為現(xiàn)代生物制藥行業(yè)中占比最大、增長(zhǎng)最快的細(xì)分領(lǐng)域。根據(jù)生產(chǎn)技術(shù)和工藝的不同，單抗類(lèi)藥物發(fā)展已經(jīng)經(jīng)歷了4 代。我國(guó)最近批準(zhǔn)上市的信迪利單抗注射液、特瑞普利單抗注射液、注射用卡瑞利珠單抗和替雷利珠單抗注射液等均屬于第3 代人源化單克隆抗體藥物。單抗類(lèi)藥物分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，容易發(fā)生二聚體、多聚體、末端氨基酸突變等不均一性變化，嚴(yán)重影響臨床用藥的安全性和有效性。對(duì)單抗類(lèi)藥物的原液和成品進(jìn)行有效的質(zhì)量控制是確保該類(lèi)產(chǎn)品安全性和有效性的重要措施。目前，單抗類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量控制與分析的主要方法包括高效液相色譜( HPLC) 法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定( ELISA) 法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳( CZE) 法、毛細(xì)管等電聚焦電泳( cIEF) 法、成像毛細(xì)管等電聚焦電泳( iCIEF) 法和十二烷基硫酸鈉-毛細(xì)管電泳( CE-SDS) 法等。本文就單抗類(lèi)藥物質(zhì)量控制分析方法及應(yīng)用進(jìn)行綜述，為相關(guān)研究及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考。

傳統(tǒng)的抗腫瘤化療藥物通過(guò)干擾腫瘤細(xì)胞有絲分裂、阻止DNA 復(fù)制和損傷DNA 分子發(fā)揮抗腫瘤作用。化療藥物不良反應(yīng)多、選擇性差的特點(diǎn)決定了其臨床應(yīng)用受到較大限制。單克隆抗體( 單抗)類(lèi)藥物是經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)手段制備的、由單一B 細(xì)胞克隆得到的高度均一的生物大分子［1-2］。單抗類(lèi)藥物抗原表位、理化性質(zhì)和生物活性等方面的均一性程度高，能夠特異性與靶標(biāo)分子結(jié)合，治療過(guò)程中不良反應(yīng)發(fā)生率低、患者的耐受性高［3-4］。從1986年全球第一個(gè)鼠源性單抗藥物Muromonab OKT3 上市以來(lái)，單抗類(lèi)藥物經(jīng)歷了人鼠嵌合單抗( 第2代) 、人源化單抗( 第3 代) 的進(jìn)步，已發(fā)展至如今的第4 代的全人源化產(chǎn)品。

治療性單抗類(lèi)藥物屬于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、分離純化和運(yùn)輸保存等過(guò)程，容易發(fā)生不均一性變化，如形成二聚體和多聚體、發(fā)生末端氨基酸突變、脫酰胺化和糖鏈變化等結(jié)構(gòu)的變異［5］。這些變異和不均一性將嚴(yán)重影響單抗類(lèi)抗腫瘤藥物的臨床效果和安全性。隨著生產(chǎn)工藝的不斷優(yōu)化和分析技術(shù)的進(jìn)步，單克隆抗體藥物的質(zhì)量控制將日趨規(guī)范和嚴(yán)格，各國(guó)藥品監(jiān)督管理部門(mén)也在不斷提升該類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量控制要求。有效的質(zhì)量控制分析方法是進(jìn)行原液和成品質(zhì)量控制、確保單抗類(lèi)產(chǎn)品安全性和有效性的基礎(chǔ)。目前，單抗類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量控制與分析的主要方法包括高效液相色譜( high performance liquid chromatography，HPLC) 法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定( enzyme linked immune-sorbent assay，ELISA) 法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳( capillary zone electrophoresis，CZE) 法、毛細(xì)管等電聚焦電泳( capillary iso-electric focusing，cIEF) 法、成像毛細(xì)管等電聚焦電泳( imaging CIEF， iCIEF) 法和十二烷基硫酸鈉-毛細(xì)管電泳( capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，CE-SDS) 法等。本文分析單抗類(lèi)產(chǎn)品分析技術(shù)與應(yīng)用進(jìn)展，為單抗類(lèi)藥物原液和成品的質(zhì)量控制提供參考。

1 單抗類(lèi)抗藥物

單抗類(lèi)藥物是生物藥物領(lǐng)域的熱點(diǎn)和研發(fā)的焦點(diǎn)，是現(xiàn)代生物制藥行業(yè)中占比最大、增長(zhǎng)最快的細(xì)分領(lǐng)域。根據(jù)生產(chǎn)技術(shù)和工藝的不同，單抗類(lèi)藥物發(fā)展經(jīng)歷了4 代。第1 代為鼠源單抗，通過(guò)小鼠細(xì)胞生產(chǎn)抗體，產(chǎn)品的不良反應(yīng)發(fā)生率高( 50% ～80%) ; 第2 代為人鼠嵌合單抗，使用人源C 區(qū)替代鼠源C 區(qū)，臨床應(yīng)用的不良反應(yīng)發(fā)生率相對(duì)較低( 1% ～ 57%) ; 第3 代為人源化單抗，采用互補(bǔ)決定區(qū)( complementary determining region，CDＲ) 移植體和特異性決定殘基( specificity-deter mining residue，SDＲ) 移植體生產(chǎn)，臨床應(yīng)用的不良反應(yīng)發(fā)生率低( ＜ 10%) ; 第4 代為全人源化單抗，采用基于噬菌體展示技術(shù)的全人單抗技術(shù)平臺(tái)生產(chǎn)，不良反應(yīng)發(fā)生率極低［6］。

單抗類(lèi)抗腫瘤藥物是單抗類(lèi)藥物家族的重要成員，因其具有較高的特異性和較低的不良反應(yīng)發(fā)生率以及患者的耐受性好而得到廣泛應(yīng)用［7-8］。近年來(lái)美國(guó)FDA 和國(guó)家藥品監(jiān)督管理局( NMPA) 均批準(zhǔn)了一系列用于治療惡性腫瘤的單抗類(lèi)藥物，如曲妥珠單抗( 赫賽汀) 、利妥昔單抗注射液( 美羅華)等，見(jiàn)表1。值得指出的是，NMPA 近2 年新批準(zhǔn)了一系列的單抗類(lèi)抗腫瘤藥物，包括信迪利單抗注射液( 2018 年12 月獲批) 、特瑞普利單抗注射液( 2018年12 月獲批) 、注射用卡瑞利珠單抗( 2019 年5 月獲批) 和替雷利珠單抗注射液( 2019 年12 月獲批)等，標(biāo)志著抗腫瘤免疫治療進(jìn)入了“中國(guó)創(chuàng)新時(shí)代”［9-10］，見(jiàn)表1。

2 單抗類(lèi)藥物的質(zhì)量控制參數(shù)

單抗類(lèi)抗腫瘤藥物分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，容易發(fā)生二聚體和多聚體、末端氨基酸突變等不均一性變化，嚴(yán)重影響臨床用藥的安全性和有效性。對(duì)抗腫瘤類(lèi)單抗產(chǎn)品的原液和成品進(jìn)行有效質(zhì)量控制是確保該類(lèi)產(chǎn)品安全性和有效性的重要措施。以我國(guó)最近批準(zhǔn)的PD-1 /PD-L1 抑制劑類(lèi)單抗為例，原液的質(zhì)量控制參數(shù)主要包括鑒別( 等電點(diǎn)、肽圖譜) 、理化檢定( 外觀、pH、滲透壓摩爾濃度) 、純度( 單體含量、重鏈、非糖基化重鏈和輕鏈等) 、雜質(zhì)( 蛋白質(zhì)A 殘留量、宿主細(xì)胞DNA 殘留量、宿主細(xì)胞蛋白殘留量) 、生物學(xué)活性( 或效價(jià)) 、蛋白質(zhì)含量、細(xì)菌內(nèi)毒素和微生物限度、糖基化分析、聚山梨酯20 等。PD-1 /PD-L1 抑制劑類(lèi)單抗成品的質(zhì)量控制的參數(shù)包括鑒別( 等電點(diǎn)、肽圖譜) 、理化檢定( 外觀、可見(jiàn)異物、不溶性微粒、裝量、pH、滲透壓摩爾濃度、復(fù)溶時(shí)間、水分) 、純度( 單體含量、重鏈、非糖基化重鏈和輕鏈等) 、生物學(xué)活性( 或效價(jià)) 、結(jié)合活性、蛋白質(zhì)含量、無(wú)菌和細(xì)菌內(nèi)毒素、異常毒性、聚山梨酯20、聚山梨酯80 含量、甘露醇含量等。

3 單抗類(lèi)抗腫瘤藥物參數(shù)分析的主要技術(shù)

單抗類(lèi)抗腫瘤產(chǎn)品參數(shù)分析的主要技術(shù)包括HPLC 法、ELISA 法、CZE 法、cIEF 法、CE-SDS 法等。

3.1 HPLC 法

用于單抗類(lèi)抗腫瘤產(chǎn)品的分析的HPLC 方法主要有反向-超高效液相色譜法( reverse phage-ultra high performance liquid chromatography，ＲP-UHPLC) 、體積排阻色譜( size exclusion high performance liquid chromatography，SEC-HPLC) 、陽(yáng)離子交換高效液相色譜( cation exchange high performance liquid chromatography，CEX-HPLC) 、離子交換高效液相色譜( ion exchange-high performance liquid chromatography，IEC-HPLC) 和熒光檢測(cè)器-高效液相色譜儀( fluorescence detector HPLC，F(xiàn)LD-HPLC) 等［21-24］。

肽圖譜分析是通過(guò)蛋白酶或其他化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行裂解后采用適宜的方法對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性進(jìn)行鑒別的手段。胰蛋白酶水解聯(lián)合ＲP-HPLC 或ＲP-UHPLC 是《中華人民共和國(guó)藥典》收載的用于生物制品肽圖檢查的方法之一，也是抗腫瘤類(lèi)單抗鑒別的重要參數(shù)。另外，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確度高，也用于分析單抗類(lèi)產(chǎn)品的肽圖。SEC-HPLC法是分析單抗分子大小異質(zhì)性的主要手段，能夠全面反映單體、單抗聚體和殘?bào)w等的信息，是單抗類(lèi)產(chǎn)品純度和雜質(zhì)質(zhì)量控制的重要方法。IEC-HPLC 可用于分析單克隆抗體抗腫瘤藥物中不同電荷異構(gòu)體的比例，與cIEF 手段結(jié)合可有效分析單抗類(lèi)抗腫瘤藥物的酸性峰、堿性峰和主峰。CEX-HPLC 屬于離子交換色譜范疇，主要用來(lái)分析等電點(diǎn)為弱堿性單抗藥物的電荷異質(zhì)性。有研究發(fā)現(xiàn)，CEX-HPLC 可以有效分離重組人源化抗白細(xì)胞分化抗原52( cluster of differentiation 52，CD52) 單克隆抗體的酸性、中性及堿性電荷變異體，且專(zhuān)屬性、線性、準(zhǔn)確性、精密度和耐用性良好［25］。將人乳頭瘤病毒( human papilloma virus，HPV) 18 型L1 抗原用胰蛋白酶水解后的肽段用反向液相色譜( ＲP-HPLC) 法分離得到抗原肽圖，并采用HPLC-MS /MS 肽圖特征峰分析可對(duì)不同企業(yè)生產(chǎn)的18 型的HPV L1 抗原進(jìn)行鑒別與質(zhì)量控制［26］。郭莎等［27］通過(guò)采用SEC-HPLC 可有效分析單體的峰面積，采用IEC-HPLC 可有效檢測(cè)酸性區(qū)峰面積、主峰峰面積、堿性區(qū)峰面積，并以此建立了抗PD-L1 單抗的多種質(zhì)控方法。在建立抗白細(xì)胞分化抗原38( cluster of differentiation 38，CD38)單克隆抗體關(guān)鍵質(zhì)量屬性質(zhì)控方法時(shí)也證實(shí)SECHPLC 分析可用于CD38 純度控制［28］。采用HPLC-肽圖法對(duì)抗人CD52 單抗的專(zhuān)屬性鑒別時(shí)也證實(shí)輔料制劑和異種抗體對(duì)CD52 單抗的檢測(cè)結(jié)果無(wú)干擾，且HPLC-肽圖適于CD52 單克隆抗體的專(zhuān)屬性鑒別、質(zhì)量控制和產(chǎn)品批放行［29］。同時(shí)，在建立PD-1 單克隆抗體關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)質(zhì)控方法時(shí)也發(fā)現(xiàn)SEC-HPLC 法、ＲP-HPLC 法及CEX-HPLC 法可進(jìn)行PD-1 單克隆抗體單體的純度、單體和聚合體含量、電荷變異體分析，這些方法是PD-1 單克隆抗體制品常規(guī)質(zhì)量控制的有效方法［30］。

3. 2 ELISA法

ELISA 法是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后出現(xiàn)的免疫酶技術(shù)，通過(guò)將可溶性的抗體或抗原分子結(jié)合到固相載體上，然后利用抗原-抗體特異性結(jié)合特性的免疫反應(yīng)進(jìn)行定性或定量的分析方法［31-32］。在抗腫瘤類(lèi)單抗藥物質(zhì)量控制過(guò)程中，ELISA 法可用于分析蛋白A 殘留、宿主細(xì)胞蛋白殘留，細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性或配體競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 法可用于單抗類(lèi)藥物生物學(xué)活性的分析。采用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法發(fā)現(xiàn)抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165 ( VEGF165) 單抗VG2 抑制VEGF 與受體結(jié)合，提示VG2 單抗能夠抑制VEGF 引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞( HUVEC) 的增殖，即競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA 方法可作為VG2 單抗生物學(xué)活性質(zhì)量評(píng)價(jià)的手段［33］。宋媛媛等［34］成功建立了基于ELISA 法進(jìn)行人血清中重組人鼠嵌合型抗CD20 單克隆抗體注射液( SCT400) 和利妥昔單抗免疫原性分析和藥物濃度檢測(cè)方法，并成功運(yùn)用于臨床試驗(yàn)樣本的免疫原性檢測(cè)。另外，采用ELISA 定量檢測(cè)方法分析抗CD52 單克隆抗體中殘留蛋白A的定量限為0.16 ng·mL-1，蛋白A 的加標(biāo)回收率均處于80%~120%，即ELISA 定量檢測(cè)方法檢測(cè)抗CD52 單抗中蛋白A 殘留量的專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度、精密度和線性均良好［35］。但ELISA 法用于單抗類(lèi)抗腫瘤藥物質(zhì)量分析時(shí)也存在一定的局限性，如需經(jīng)過(guò)孵育和洗滌等多步操作、容易受到外源或內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，檢測(cè)依賴高親和力和高特異性的高品質(zhì)單克隆抗體試劑等。已有的證據(jù)顯示不同的單抗類(lèi)藥物與脫落的蛋白A 的結(jié)合程度不同［36］，需要根據(jù)不同單抗產(chǎn)品特性進(jìn)行相關(guān)的研究，建立適合于特定單克隆抗體的蛋白A 殘留ELISA 檢測(cè)方法。

3.3 CE-SDS 法

十二烷基硫酸鈉( SDS) 是陰離子表面活性劑，可以斷裂蛋白分子分子內(nèi)和分子間的氫鍵、破壞其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)使其伸展。雖與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDSPAGE)法的電泳原理相同，CE-SDS 是液態(tài)膠在毛細(xì)管中按照分離量的大小進(jìn)行蛋白的分離，自動(dòng)化程度高，分離效率和重復(fù)性均優(yōu)于SDS-PAGE［37］。在單抗類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量控制領(lǐng)域，CE-SDS 法已經(jīng)基本取代了SDS-PAGE 法。《中華人民共和國(guó)藥典》也將CESDS法作為單抗藥物分子大小變異體的分析手段。根據(jù)樣品處理過(guò)程中使用N-乙基順丁烯二酰亞胺( NEM) 或β 巰基乙醇的不同，CE-SDS 法區(qū)分為非還原CE-SDS 法和還原CE-SDS 法( 使用β 巰基乙醇、二硫蘇糖醇等還原劑進(jìn)行樣品處理) 。通過(guò)CESDS法分析可將目標(biāo)成分和雜質(zhì)有效分離，且能區(qū)分多批重組人源化PD-1 單抗產(chǎn)品間的細(xì)小差異，即CE-SDS 法適用于PD-1 單抗產(chǎn)品純度和相關(guān)雜質(zhì)的質(zhì)控分析［30］。在應(yīng)用CE-SDS 法分析抗CD52 單抗參比品單體純度和非糖化重鏈比例時(shí)發(fā)現(xiàn)非還原CE-SDS 法測(cè)定單體純度為93. 57%，還原CE-SDS法電泳重鏈修正峰面積為66.89%，CE-SDS 法測(cè)定抗CD52 單抗純度及非糖化重鏈比例偏差小，結(jié)果準(zhǔn)確可靠［38］。郭莎等［27］在對(duì)抗PD-L1 單抗的質(zhì)量控制進(jìn)行分析時(shí)證實(shí)還原CE-SDS 法的輕鏈與重鏈峰面積之和為( 98.37 ± 0. 21) %，非還原CE-SDS 法主峰峰面積為( 96.33 ± 0.15) %，CE-SDS 法可用于抗PD-L1 單抗純度的質(zhì)量控制。在采用CE-SDS 法分析HEＲ2 單抗質(zhì)量時(shí)也發(fā)現(xiàn)非還原CE-SDS 法檢測(cè)的酸性異構(gòu)體、預(yù)洗脫雜質(zhì)、原液的主峰含量為90.83%，53.93%， 95.83%，小分子雜質(zhì)含量分別為9.17%， 46.07%，4.17%，還原CE-SDS 法檢測(cè)的酸性異構(gòu)體、預(yù)洗脫雜質(zhì)、原液的輕、重鏈百分含量分別為96.80%，78.00%， 98.85%，即CE-SDS 法可用于HEＲ2 單抗的純度分析［20］。非糖基化重鏈?zhǔn)强贵w藥物質(zhì)量控制的關(guān)鍵參數(shù)，對(duì)抗體藥物的體內(nèi)外穩(wěn)定性、半衰期等生物學(xué)活性起關(guān)鍵的作用，而CESDS法是目前唯一能夠?qū)⒖贵w非糖基化重鏈與重鏈進(jìn)行分離和進(jìn)行準(zhǔn)確定量的技術(shù)［39］。目前采用CE-SDS 法分析單抗藥物純度時(shí)采用的檢測(cè)手段主要為紫外檢測(cè)( UV 和PDA) 和激光誘導(dǎo)的熒光檢測(cè)。與前者相比，激光誘導(dǎo)的熒光檢測(cè)靈敏度高，可對(duì)痕量的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，而紫外檢測(cè)器可消除背景膠中紫外吸收引起的基線波動(dòng)，自動(dòng)積分更準(zhǔn)確［40-41］。為保證CE-SDS 法可靠穩(wěn)定，研究人員采用了在毛細(xì)管兩端增加相同的電壓、反吸法移取凝膠溶液等手段提高CE-SDS 法的穩(wěn)定性，并采用多通道毛細(xì)管電泳分析抗體藥物純度以提高檢測(cè)的通量［42-43］。

3.4 cIEF 法與iCIEF法

cIEF 和iCIEF 均屬于毛細(xì)管電泳的范疇，在基于電荷的分離技術(shù)中其分辨率是最高的［44 － 45］。根據(jù)待分離物質(zhì)等電點(diǎn)的不同，將其在pH 梯度內(nèi)將酸堿兩性物進(jìn)行電泳分離，并最終在與物質(zhì)等電點(diǎn)相等pH 值的位置聚集成條帶。單抗類(lèi)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中涉及糖基化、末端氨基酸改變、異構(gòu)化、聚合、分裂等翻譯后修飾，而這些修飾均會(huì)引起單抗表面電荷的改變，包括直接改變電荷的數(shù)目和間接引起構(gòu)象的改變，即單抗類(lèi)抗腫瘤藥物的電荷異質(zhì)性。在單抗類(lèi)抗腫瘤產(chǎn)品質(zhì)量控制過(guò)程中，cIEF 法和iCIEF`法主要用于分析產(chǎn)品的等電點(diǎn)和電荷異質(zhì)性［46 -47］。在對(duì)重組抗腫瘤壞死因子α ( TNF-α) 全人源單抗分析時(shí)發(fā)現(xiàn)cIEF 法和iCIEF 法可用于主峰與酸性峰的比例分析，但二者檢測(cè)抗體主峰等電點(diǎn)具有差異性，提示在實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)結(jié)合單抗藥物的特性和表征選擇合適的電荷異質(zhì)性分析方法［48］。劉振東等［49］建立了iCIEF 分析血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-抗體Fc 融合蛋白的電荷異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)iCIEF 法分離效果明顯好于cIEF 和IEF，即iCIEF 法用于重組蛋白類(lèi)藥物電荷異質(zhì)性及等電點(diǎn)快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，能夠較好地檢測(cè)高度糖基化的重組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-抗體Fc 融合蛋白產(chǎn)品的電荷異質(zhì)性，保障了Fc-融合蛋白類(lèi)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，為該產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了快速、可靠的分析方法。在評(píng)價(jià)全柱成像毛細(xì)管電泳( capillary isoelectric focusing-whole column imaging detection，cIEF-WCID) 檢測(cè)多肽類(lèi)藥物等電點(diǎn)的效果時(shí)，證實(shí)該方法可快速、準(zhǔn)確地分析具有電荷異質(zhì)性的多肽類(lèi)產(chǎn)品的等電點(diǎn)，且能夠跟蹤聚焦過(guò)程中樣本的遷移特征，對(duì)復(fù)雜電荷異質(zhì)性蛋白類(lèi)藥物檢測(cè)具有較好的分辨率和重復(fù)性［50］。美國(guó)藥典36 版也收錄了cIEF 作為單抗類(lèi)藥物曲妥珠單抗和利妥昔單抗的電荷異質(zhì)性分析方法。除了單克隆抗體外，cIEF 也可以對(duì)抗體偶聯(lián)藥物( antibody-drug conjugate，ADC) 進(jìn)行電荷異質(zhì)性的分析［51-52］。

3.5 毛細(xì)管凝膠電泳( capillary gel electrophoresis，CGE) 法

在毛細(xì)管電泳的多種分離模式中，CEZ法分析主要依靠分子量大小進(jìn)行分離，cIEF 分析依靠單抗的等電點(diǎn)進(jìn)行分離，而CEZ 法是依靠單抗類(lèi)藥物電荷/質(zhì)量比進(jìn)行分析，是最簡(jiǎn)單、最常用的毛細(xì)管電泳類(lèi)型。由于單抗類(lèi)藥物各個(gè)變異體之間的質(zhì)量差別不大，主要變異來(lái)自氨基酸的翻譯后修飾，具體體現(xiàn)在表面電荷的不同。CEZ 法的分離模式與cIEF 法相似，但前者比后者更簡(jiǎn)單、更便捷。CEZ法與質(zhì)譜聯(lián)用后可以依靠后者對(duì)毛細(xì)管電泳分離的電荷變異體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。在對(duì)IgG2 型單抗電荷異質(zhì)性進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析時(shí)證實(shí)CZE 法可以有效分離IgG2 單抗電荷異構(gòu)體，精密度良好，峰面積ＲSD ＜ 3. 0%，提示CZE 法可以對(duì)該類(lèi)單克隆抗體的電荷異構(gòu)體有效分離［53］。在對(duì)常用的單克隆抗體電荷異質(zhì)性分析時(shí)證實(shí)IEC 法和CZE 法在檢測(cè)的電荷異構(gòu)體峰面積時(shí)結(jié)論基本一致，但二者與CIEF 法和iCIEF 法檢測(cè)的抗體主峰等電點(diǎn)存在一定差異［38］。雖然CEZ 法操作簡(jiǎn)單便捷，但單抗類(lèi)藥物的多樣性決定了沒(méi)有任何一個(gè)分離條件能對(duì)所有的藥物實(shí)現(xiàn)最佳的分離效果。在采用CZE 法分析單抗類(lèi)藥物的電荷異質(zhì)性時(shí)，應(yīng)綜合考慮pH值、三乙烯四胺( TETA) 濃度、羥丙基甲基纖維素( HPMC) 或羥丙基纖維素( HPC) 等聚合物添加劑等因素。

3.6 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( polymerase chain reaction，PCＲ) 法及其他

外源性DNA 是通過(guò)病毒感染或基因工程等途徑引入靶細(xì)胞的其他物種或細(xì)胞的DNA 序列，是單抗類(lèi)等生物制品質(zhì)量控制的關(guān)鍵項(xiàng)目［54-55］?，F(xiàn)行有效的國(guó)際主流藥典都對(duì)生物制品中外源DNA 殘留做了明確的限度規(guī)定。定量PCＲ 法、閾值法、熒光染料法及分子雜交等都是分析外源性DNA 的常用手段，其中定量PCＲ 法是目前批準(zhǔn)的抗腫瘤類(lèi)單克隆抗體產(chǎn)品中外源性DNA檢測(cè)的通用方法。最近新上市的信迪利單抗注射液、注射用卡瑞麗珠單抗及特瑞普利單抗注射液等均是來(lái)自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞( CHO) ，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、分離和純化后獲得的重組單克隆抗體。目前這類(lèi)抗腫瘤單抗的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中均是采用定量PCＲ 法對(duì)相應(yīng)的外源性DNA 進(jìn)行分析。

單抗類(lèi)抗腫瘤產(chǎn)品的原液通常是采用常規(guī)法或薄膜過(guò)濾法進(jìn)行微生物限度檢查，產(chǎn)品的無(wú)菌檢查均采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行; 蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)采用紫外分光光度法進(jìn)行; 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)采用凝膠法進(jìn)行。支原檢查可采用PCＲ 法進(jìn)行初篩和產(chǎn)品放行，但結(jié)果存在爭(zhēng)議時(shí)要以培養(yǎng)法結(jié)果為仲裁標(biāo)準(zhǔn)。其他的分析項(xiàng)目，如外觀、性狀、可見(jiàn)異物、摩爾滲透壓、pH 值、裝量和不溶性微粒及異常毒性等均采用常規(guī)法。

4 問(wèn)題與展望

單抗類(lèi)藥物已成為制藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。在全球生物制藥領(lǐng)域中，單抗類(lèi)藥物占據(jù)了50%左右的份額。單抗類(lèi)抗腫瘤藥物是單抗類(lèi)藥物的重要組分，且隨著信迪利單抗注射液、特瑞普利單抗注射液、注射用卡瑞利珠單抗和替雷利珠單抗注射液等一系列抗腫瘤單抗的獲批，抗腫瘤免疫治療進(jìn)入了“中國(guó)創(chuàng)新時(shí)代”。單抗類(lèi)抗腫瘤藥物為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，經(jīng)翻譯后修飾容易發(fā)生二聚體、多聚體、末端氨基酸突變、糖基化等不均一的變化，嚴(yán)重影響臨床用藥的安全性和有效性。為確保抗腫瘤類(lèi)單抗產(chǎn)品安全性和有效性，需對(duì)原液和成品進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。目前單抗類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量控制與分析的主要方法包括HPLC 法、ELISA 法、CZE法、cIEF 法、iCIEF 法和CE-SDS 法等。本文對(duì)上述的常用分析方法及應(yīng)用進(jìn)行了綜述，可為相關(guān)研究及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考。但應(yīng)當(dāng)指出的是由于單抗類(lèi)抗腫瘤藥物的迅猛發(fā)展，不同的單抗產(chǎn)品質(zhì)量控制所采用的方法可能與藥物的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、電荷屬性等因素有關(guān)。因此，為確保所采用的方法適合于特定的產(chǎn)品，需對(duì)產(chǎn)品的理化特性進(jìn)行分析研究，建立適合于特定單克隆抗體的分析方法。