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本文標(biāo)題問(wèn)題的存在基礎(chǔ)是，有的方法學(xué)驗(yàn)證設(shè)計(jì)了4個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，比如定量限、50%、100%、150%，對(duì)于那些僅設(shè)置50%、100%、150%或者80%、100%、120%等濃度水平，不考慮更低濃度水平的驗(yàn)證而言，問(wèn)題就不復(fù)存在了。

那到底這種做法來(lái)源于哪兒？有一個(gè)但不唯一的來(lái)源可能是ICHQ2（R1）中關(guān)于定量限驗(yàn)證時(shí)的“Recommended Data”：

原文：The limit （quantitationlimit）should be subsequently validated bythe analysis of a suitable number of samples known to be near or prepared atthe quantitation limit.

譯文：定量限需要分析適當(dāng)數(shù)量的樣品去驗(yàn)證，這些樣品中的雜質(zhì)濃度應(yīng)該接近定量限或按定量限濃度進(jìn)行制備。

因此，在該問(wèn)題存在的前提下，本文拋磚引玉，淺談一些想法。

對(duì)于這個(gè)問(wèn)題，不得不先說(shuō)一下方法學(xué)驗(yàn)證中的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，想必大家應(yīng)該很熟悉了，中國(guó)藥典2020年版通則9101給出的定義為，準(zhǔn)確度系指用所建立方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近的程度，一般用回收率（%）表示。

具體做法想必也無(wú)需贅述，但具體實(shí)施卻有變化，有發(fā)展。以中國(guó)藥典為例，2020年版藥典相對(duì)于2015年版藥典，在具體的描述上有很多不同之處，這些不同之處傳遞的信號(hào)表明方法學(xué)驗(yàn)證趨向于更加科學(xué)和合理，更加貫徹了為使用目的而驗(yàn)證的核心理念。

比如說(shuō)，對(duì)于準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)一般做法的描述，兩版藥典的描述對(duì)比如下：

 

 

其實(shí)并不是從2020版藥典開(kāi)始，不知從何時(shí)起，業(yè)內(nèi)有人開(kāi)始在做準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)時(shí)，不再局限于低、中、高三個(gè)濃度的考察了，進(jìn)一步設(shè)置了定量限水平的回收率，理由當(dāng)然也很充分。很多人聽(tīng)說(shuō)了這個(gè)做法，也去做了，只是做的有點(diǎn)痛苦。其中明顯的區(qū)別是2015版藥典對(duì)于加標(biāo)水平的描述，在2020版藥典里被一句話給概括了：濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。如此一來(lái)，對(duì)于濃度水平的設(shè)定就說(shuō)的非常清楚但不具體，這顯得非常指導(dǎo)原則。

 

具體做法不一而足，就業(yè)內(nèi)存在的一種做法示例如下：

 

1、先做定量限考察：一般以信噪比為10：1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。

2、回收率考察：除了常規(guī)的低、中、高三個(gè)濃度（比如50%、100%、150%），在定量限濃度設(shè)置回收率考察。

3、計(jì)算12個(gè)加標(biāo)水平回收率的RSD值。

 

那么我們簡(jiǎn)單分析一下上述做法為什么會(huì)很痛苦：

 

1、假設(shè)這個(gè)方法有10個(gè)雜質(zhì)，如果不幸運(yùn)的話，因?yàn)楦鱾€(gè)雜質(zhì)響應(yīng)的差異，按信噪比為10：1考察，可能出現(xiàn)這10個(gè)雜質(zhì)的定量限濃度各不相同。那么加標(biāo)試驗(yàn)就需按10個(gè)雜質(zhì)各自的定量限濃度配制，不管怎么設(shè)計(jì)，想想都挺麻煩。

2、在好不容易把溶液設(shè)計(jì)配制好，進(jìn)樣分析時(shí)，還在擔(dān)心這個(gè)水平的回收率是否能通過(guò)擬定的驗(yàn)證要求，畢竟?jié)舛鹊停`差大。

3、在忐忑中迎來(lái)了數(shù)據(jù)處理的時(shí)刻，萬(wàn)幸各個(gè)雜質(zhì)的定量限水平回收率都滿足擬定的要求，比如說(shuō)85%~115%（有人比較聰明，把定量限水平回收率限度放寬了）。確實(shí)都在85%~115%范圍內(nèi)沒(méi)錯(cuò)，但可能出現(xiàn)了偏低或偏高的情況，而正常濃度水平的回收率范圍設(shè)置的是90%~108%，基本處于100%左右，此時(shí)合并計(jì)算12個(gè)水平的RSD出了問(wèn)題，超標(biāo)了！又有聰明人說(shuō)了，定量限水平的回收率我們不參與RSD的計(jì)算，是否可行暫且不論，這個(gè)不參與計(jì)算的邏輯基礎(chǔ)在哪兒呢？因?yàn)閰⑴c后不合格嗎？

 

何必為難自己呢？下面提供一種“包過(guò)”的做法，不過(guò)僅供參考，拋轉(zhuǎn)引玉：

 

定量限濃度的回收率該怎么做？這個(gè)問(wèn)題不妨換一種說(shuō)法：相對(duì)于50%的加標(biāo)水平，為了把方法驗(yàn)證的更加充分，更低濃度的加標(biāo)回收率該怎么做？更低濃度不等于信噪比為10:1的定量限濃度，也沒(méi)有這種要求。

 

話不多說(shuō)，先上實(shí)施例：

 

1、假設(shè)某有關(guān)物質(zhì)方法需要檢測(cè)8個(gè)雜質(zhì)，樣品濃度為1mg/ml，雜質(zhì)限度為均不得過(guò)0.15%。

2、根據(jù)藥典一般要求以及一般做法，按信噪比10:1考察各個(gè)雜質(zhì)的定量限濃度，假設(shè)考察結(jié)果如下：

 

 

2、相對(duì)于限度0.15%百分比（%）：將0.15%作為加標(biāo)100%的水平時(shí)，定量限濃度相對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平。注：1、相對(duì)于樣品濃度百分比（%）：定量限濃度除以樣品濃度（1mg/ml），乘以100%。

3、根據(jù)定量限考察結(jié)果，8個(gè)雜質(zhì)中靈敏度最差的為IMP-5與IMP-8。那么回收率加標(biāo)水平除了常規(guī)的低、中、高三個(gè)點(diǎn)設(shè)計(jì)外，各個(gè)雜質(zhì)更低水平的加標(biāo)濃度可以統(tǒng)一設(shè)置為15%~20%即可。

上述實(shí)施例僅作為一種可參考的具體方式，除此之外，可以更加簡(jiǎn)單粗暴的進(jìn)行回收率加標(biāo)水平的設(shè)置。比如，在綜合考慮了雜質(zhì)限度要求以及各個(gè)雜質(zhì)的定量限水平后，可直接設(shè)置30%、100%、150%，或者30%、80%、120%三個(gè)水平的回收率試驗(yàn)。

我們都是愛(ài)學(xué)習(xí)，勤思考的好同志，所以必須要問(wèn)一句，上述做法的理論基礎(chǔ)在哪兒，內(nèi)在邏輯是什么，有沒(méi)有法規(guī)支持，有沒(méi)有審評(píng)風(fēng)險(xiǎn)？

下面我們就來(lái)找一下這方面的信息，給自己一個(gè)安慰，也給他人一個(gè)交代。

 

理論基礎(chǔ)及法規(guī)支持：

 

1、各國(guó)藥典以及ICH說(shuō)，分析方法驗(yàn)證的目的是證明建立的方法適合于相應(yīng)檢測(cè)要求。

2、ICH對(duì)于回收率的要求：

原文：Accuracyshould be assessed using a minimum of 9 determinations over a minimum of 3concentration levels covering the specified range (e.g., 3 concentrations/3replicates each of the total analytical procedure).

譯文：準(zhǔn)確度應(yīng)該采用至少3個(gè)濃度（涵蓋擬定的范圍）9份樣品進(jìn)行評(píng)估（比如3個(gè)濃度各3份平行樣）。

解析：其中關(guān)于加標(biāo)濃度的描述為“coveringthe specified range”，那么我們進(jìn)一步看一下“specifiedrange”是如何規(guī)定的：

原文：forthe determination of an impurity: from the reporting level of an impurity to120% of the specification。

譯文：對(duì)于雜質(zhì)檢測(cè)而言，范圍應(yīng)該包括雜質(zhì)的報(bào)告限（ICHQ3A、ICHQ3B）至限度的120%。

解析：范圍下限一般為0.05%（對(duì)于大于2g/天的原料藥為0.03%，制劑會(huì)更高）。

 

內(nèi)在邏輯：

 

1、滿足使用需求：控制需求一般是報(bào)告限（0.05%）至限度的120%，且并無(wú)加標(biāo)水平的明確設(shè)置要求，理論上可以在該范圍內(nèi)任意設(shè)置。

2、定量限的要求：一般情況下雜質(zhì)的定量限不高于ICH要求的報(bào)告限即可滿足要求（最多我們自己嚴(yán)格要求一下，再設(shè)置一個(gè)更低點(diǎn)的忽略限）。因此，假設(shè)雜質(zhì)限度為0.15%，報(bào)告限為0.05%，那么定量限做到0.01%~0.02%足以滿足檢測(cè)要求，可據(jù)此設(shè)置合理的樣品濃度或者進(jìn)樣體積。

3、對(duì)于雜質(zhì)限度為0.15%的情況，其加標(biāo)水平在20%或30%時(shí)對(duì)應(yīng)的限度是0.03%或0.045%，可見(jiàn)足以滿足產(chǎn)品的質(zhì)量控制需求。可能有人說(shuō)了，我們樣品實(shí)際檢出雜質(zhì)都是0.003%的水平。怎么說(shuō)呢，信不信把你的樣品濃度再加大10倍，還可以看到很多之前看不到的雜質(zhì)！

由于各個(gè)雜質(zhì)的響應(yīng)差異，在同一樣品濃度和進(jìn)樣體積的情況下，可能某些雜質(zhì)的定量限異常低，此時(shí)如果按該濃度做加標(biāo)回收，可想而知的難度。

 

審評(píng)風(fēng)險(xiǎn)：

 

審評(píng)并不是一刀切，無(wú)需過(guò)分擔(dān)心，有理走遍天下，何況是科學(xué)的道理。當(dāng)然我們可以選擇簡(jiǎn)單但更為保守的做法，比如在雜質(zhì)靈敏度滿足要求的情況下，更低加標(biāo)水平統(tǒng)一設(shè)置為10%，相對(duì)于100%的限度水平，已是十分之一，應(yīng)該足以滿足質(zhì)量控制需求了吧。真的無(wú)需對(duì)各個(gè)雜質(zhì)在各自的定量限濃度進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。

類似的驗(yàn)證同樣如此，滿足使用目的和要求即可。比如線性與范圍，對(duì)于限度為0.15%的雜質(zhì)，范圍驗(yàn)證到10%顯然是沒(méi)有必要的，即使線性良好；再比如，對(duì)于忽略限為0.02%~0.03%的雜質(zhì)檢測(cè)，把定量限做到0.0001%（信噪比為10）顯然也是沒(méi)有必要的，即使方法靈敏度確實(shí)能做到這么高。總之，方法需要合理的設(shè)計(jì)，驗(yàn)證無(wú)需過(guò)度。

 

結(jié)語(yǔ)：

 

本文所述可能不具有普適性，僅代表業(yè)內(nèi)一部分人的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，對(duì)于有的團(tuán)隊(duì)可能壓根不存在上述情況。還是那句老話，本文拋磚引玉以供討論，哪怕對(duì)百里有一能夠有所啟發(fā)已是功德圓滿。