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無(wú)菌檢查試驗(yàn)

 

1、無(wú)菌檢查適用于什么樣品？

 

無(wú)菌檢查法用于檢查藥典要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器械、原料、輔料及其他品種是否無(wú)菌的一種方法。若供試品符合無(wú)菌檢查的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。

 

2、進(jìn)行無(wú)菌檢查時(shí)對(duì)檢測(cè)環(huán)境有什么要求？

 

無(wú)菌檢查應(yīng)在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，試驗(yàn)環(huán)境必須達(dá)到無(wú)菌檢查要求，檢驗(yàn)全過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及受控環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度確認(rèn)。隔離系統(tǒng)應(yīng)定期按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。日常檢驗(yàn)需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

 

3、無(wú)菌試驗(yàn)需要用到什么培養(yǎng)基，培養(yǎng)基要符合什么要求？

 

無(wú)菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查及靈敏度檢查的要求。培養(yǎng)基適用性檢查可在供試品的無(wú)菌檢查前或者與供試品無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。

 

4、方法適用性試驗(yàn)是什么？與無(wú)菌檢查有什么關(guān)系？

 

進(jìn)行產(chǎn)品無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

 

5、方法適用性試驗(yàn)

 

菌種制備

 

注：中國(guó)藥典中方法驗(yàn)證試驗(yàn)與培養(yǎng)基靈敏度檢驗(yàn)所用菌種區(qū)別：大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌。

 

檢測(cè)方法

 

（1）薄膜過(guò)濾法

 

按供試品的無(wú)菌檢查的要求，取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品的總量，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入不大于100 cfu的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。加培養(yǎng)基至濾桶內(nèi)，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌的濾筒內(nèi)加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的濾筒內(nèi)加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得超過(guò)5天。

 

（2）直接接種法

 

取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基6管，分別接入小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另一管作為對(duì)照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得超過(guò)5天。

 

結(jié)果判斷

 

與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。

 

如含供試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則供試品的該檢驗(yàn)量在檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，可采用：

 

a) 增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基用量。

 

b) 使用中和劑，或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。

 

注: 方法適用性試驗(yàn)可與供試品無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。

 

6、供試品無(wú)菌檢查

 

陽(yáng)性對(duì)照

 

a) 無(wú)抑菌作用或抗革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌

 

b) 抗革蘭氏陰性菌：大腸埃希菌

 

c) 抗厭氧菌：生孢梭菌

 

d) 抗真菌：白色念珠菌

 

菌液制備同方法適用性試驗(yàn)，加菌量小于100cfu，培養(yǎng)不超過(guò)5天，應(yīng)生長(zhǎng)良好。

 

陰性對(duì)照

 

a) 薄膜過(guò)濾法：相應(yīng)的溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作

 

b) 直接接種法：采用未接種的培養(yǎng)基

 

陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。

 

檢測(cè)方法

 

無(wú)菌檢查法包括薄膜過(guò)濾法和直接接種法。只要供試品形狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。進(jìn)行供試品無(wú)菌檢查時(shí)，所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法相同。檢驗(yàn)數(shù)量由委托人指定。

 

（1）薄膜過(guò)濾法

 

薄膜過(guò)濾法應(yīng)優(yōu)先采用封閉式薄膜過(guò)濾器，無(wú)菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45 μm，濾膜直徑約為50 mm。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100 ml，且總沖洗量不得超過(guò)500 ml，最高不得超過(guò)1000 ml以避免濾膜上的微生物受損傷。

 

（2）直接接種法

 

每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15 ml，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10 ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗(yàn)證試驗(yàn)；每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗(yàn)數(shù)量。

 

培養(yǎng)觀察

 

將接種供試品后的培養(yǎng)基容器培養(yǎng)不少于14天；接種生物制品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應(yīng)一份置30-35℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，一份置20-25℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。

 

如在加入供試品后或在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基出渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液不少于1 ml轉(zhuǎn)種至同種培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)不少于4天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。

 

結(jié)果判斷

 

陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)，否則試驗(yàn)無(wú)效。供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判定符合規(guī)定；供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判定不符合規(guī)定。當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效：

 

a) 無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求；

 

b) 回顧無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；

 

c) 陰性對(duì)照管有菌生長(zhǎng)；

 

d) 供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使用的物品和(或)無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。