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嘉峪檢測網 2021-09-08 11:50
1.概述
本文對單一小分子化合物（多組分化合物除外）的結構確證相關內容進行梳理概括。
2.小分子化合物進行結構確證的一般順序
單一組分化合物通常是定向合成、天然產物提取、發(fā)酵提取或半制備等方式制備得到，通過液相或氣相等檢測手段評估純度（原料藥純度通常≥99.0%；雜質純度通常≥90.0%）后，主要通過核磁共振氫譜（1H-NMR）、光譜及常規(guī)質譜（MS）等方法，基于合成機理推斷平面結構；如合成機理不明確，采用提取方式獲得，或氫譜及質譜等常規(guī)方法對化合物結構判斷的信息作用不大，則需要投入更多確證方法來輔助結構判斷，如借助碳譜（13C-NMR），二維核磁等來確證；在解析得到平面結構后，如判斷存在立體構型，應采用針對立體結構相應的研究手段，如NOESY、圓二色譜（CD）、單晶衍射等進行確證。
3.小分子化合物進行結構確證的研究手段
化合物結構初步確證后，按照相關指導原則，筆者根據(jù)化合物類別，對原料藥（新化學實體、已知化合物）、起始物料/中間體/雜質（新化合物、已知化合物）結構確證的相關研究內容列表整理如下[1~3]。
表1 不同類別化合物的結構確證方法判斷
4.結構確證經驗總結
下文是筆者對曾用到的結構確證相關技術進行的簡單闡述，因結構解析是一門系統(tǒng)的學科，內容較多且精深，在此不做具體結構解析的陳述。
4.1.高分辨質譜（HRMS）/質譜（MS）
與常規(guī)質譜相比，高分辨質譜（HRMS）測得化合物的分子量可精確至小數(shù)點后第四位，常用于輔助確定化合物的分子質量和和分子式，前提是通過核磁共振波譜已初步確定化合物結構。某些情況下，質譜可以起到結構確證的關鍵作用。
筆者曾解析一新化合物，在初步推斷得到平面結構后，發(fā)現(xiàn)分子量與推斷的結構不一致。仔細觀察質譜發(fā)現(xiàn)，在分子離子峰右側還有一M+2的離子峰（豐度比約3:1），才恍然醒悟分子結構中含有氯原子，新化合物結構得以破解。
鹵素常有同位素峰，分子結構中存在的氯（Cl）和溴（Br）較典型，當分子中含有1個氯或溴時，相對豐度比分別為3:1或1:1；含有多個氯或溴時，筆者一般是手動計算，或采用Chemdraw中的Analysis m/z值來判斷。
質譜解析中還有一條大家都比較熟悉的“氮規(guī)則”：化合物分子不含氮或含偶數(shù)個氮原子時，其分子離子的質量是偶數(shù)；化合物分子含奇數(shù)個氮原子時，其分子離子的質量是奇數(shù)。
4.2.元素分析
元素分析對化合物中的各元素進行含量測定，確定各元素的百分含量。
針對各元素的特點，元素分析可選擇的方法較為多樣。碳、氫、氮元素檢測通常采用燃燒分解法；含鹵素或硫的化合物，采用氧瓶燃燒-滴定法（中國藥典2020年版四部通則0703）；金屬元素可采用電感耦合等離子發(fā)射光譜法（ICP-OES）；磷元素可采用酸分解-比色法等。
測定完畢，比較測試結果與理論結果差值的大小，指導原則[1]規(guī)定“一般要求誤差不超過0.3％”，在實際遇到的一些案例中，會存在樣品容易吸潮或化合物含較多游離水，導致測試結果與理論結果誤差超過0.3%。在元素分析解析時，建議元素百分含量測定值扣除化合物的水分測定結果后，再與理論值比較誤差。
4.3.一維核磁共振波譜
取化合物2mg~10mg裝入核磁管，用合適的氘代試劑進行溶解，用核磁共振波譜儀（頻率通常400M~800M）進行檢測，內標物為四甲基硅烷（TMS）。
1H的天然豐度較13C高很多，核磁測試時，兩者頻率通常是4倍關系，如氫譜（1H NMR）600M頻率對應碳譜（13C NMR）150M頻率；碳譜的響應較氫譜低，如果化合物量較少，在測試碳譜時，可通過積累掃描時長增加碳譜的響應；分子量大的化合物較分子量小的化合物檢測用量要多。
氘代試劑的選擇也非常關鍵，比較常見的氘代試劑有DMSO-d6，CDCl3，D2O，Methanol-d4，(CD3)2CO等。某些情況下，化合物的化學位移可能與氘代試劑（或氘代試劑中存在的水）在氫譜或碳譜中的化學位移重疊，影響結構確證，就需要更換氘代試劑進行測定。
指導原則[1]規(guī)定“對含有活潑氫的藥物必需進行氘代實驗，以提供活潑氫的存在以及位置的信息。”，選擇氘代試劑時，可采用重水交換來確認活潑氫的存在。同時，可結合二維1H-1H COSY譜進行確認。
核磁出圖后，研發(fā)人員常用MestRenova軟件對圖譜進行化學位移和積分處理，采用Chemdraw軟件預測化合物的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)，輔助判斷平面結構。
如果化合物為已知化合物，通過與文獻報道的氫譜（1H NMR）或碳譜（13C NMR）數(shù)據(jù)進行比對，則較易解析。
微譜數(shù)據(jù)庫可進行檢索查新，目前數(shù)據(jù)庫中已收載137萬多種化合物的碳譜數(shù)據(jù)，為植物化學或天然產物研發(fā)工作者提供了較大的便利。只需在微譜數(shù)據(jù)庫中錄入已獲得的碳譜數(shù)據(jù)，則能很快獲得文獻已發(fā)表化合物和待解析化合物的相似度。該數(shù)據(jù)庫需要收費[4]。
除了氫譜（1H NMR）和碳譜（13C NMR），DEPT（無畸變極化轉移增強技術）和APT（碳連氫譜）也是一維核磁波譜。DEPT和APT譜用得較少，它們的作用是判斷碳的類型。普通13C-NMR出的化學位移棒均是“朝上（正）”，DEPT和APT譜出的化學位移棒“有上（正）有下（負）”，常用135°DEPT。在135°DEPT實驗中所有的季碳都不出峰，伯、叔碳為正（棒朝上），仲碳為負（棒朝下）。APT譜中季碳可以出峰，信號強度較DEPT譜增加。
4.4.二維核磁共振波譜
二維核磁共振波譜是對平面結構進行確證的關鍵。常用的為：HMBC（檢出1H異核多鍵相干技術）、HSQC（檢出1H異核單量子相干技術）、COSY（同核位移相關譜）、NOESY（核極化效應相關譜）。
HMBC對推斷結構最為高效，它是看相隔2個或3個鍵氫原子與碳原子的遠程相關性；COSY（通常是1H-1HCOSY）看相鄰碳相連氫原子的相關性；HSQC看直接相連的碳氫相關性。通常通過這三種技術，即可初步確認化合物的平面結構。
JNP（Journalof Natural Products）雜志近期發(fā)表的某新的萜類化合物1的平面結構推斷見圖1，紅色箭頭表示的是根據(jù)HMBC譜推斷的碳氫相關性，藍色粗線表示的是1H-1H COSY譜推斷的氫氫相關性。該化合物平面結構確證后，其相對構型通過NOESY譜進行確定，NOESY譜上可反映空間上的氫氫相關性，見圖2，黑色箭頭標出了空間氫原子相關。詳細的解析過程和核磁共振圖譜數(shù)據(jù)可查詢參考文獻[5]。
圖1 新化合物1平面結構（紅色箭頭：HMBC；藍色粗線：key COSY）
圖2 新化合物1空間NOE相關性（黑色箭頭：NOESY）
4.5.圓二色譜（CD）
圓二色譜（CD）是用于推斷非對稱分子的構型和構象的一種旋光光譜，可用于確證化合物的絕對構型。
上述新化合物1在通過二維核磁波譜確定了平面結構和相對構型后，通過圓二色譜計算結果與實驗結果的擬合（見圖3），最終確定了其絕對構型。
圖3 新化合物1的圓二色譜及立體構型
4.6.單晶X-射線衍射（XRSD）
單晶X-射線衍射（XRSD）也是確定絕對構型的常用方法，可測定晶態(tài)分子的晶胞參數(shù)、晶系、空間群，可提供一個化合物在晶態(tài)中所具有原子的精確空間位置。該技術主要涉及單晶培養(yǎng)和檢測。晶體培養(yǎng)難度較大，需不斷嘗試且有足夠耐心。
劍橋晶體數(shù)據(jù)中心（CCDC, the Cambridge Crystallographic Data Centre）自1965年起就從事晶體數(shù)據(jù)的收集、整理與計算機化工作，該中心發(fā)展的劍橋結構數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)CSDS(CSDS，the Cambridge Structural Database System)是基于X光和中子衍射實驗唯一的小分子及金屬有機分子晶體的結構數(shù)據(jù)庫（網址：https://www.ccdc.cam.ac.uk/structures/），其中收錄了113萬多化合物的晶體結構，每一個化合物均有自己的CCDC編號[6]。
圖4是新化合物2的熱橢圓形點圖（ORTEP圖）和CCDC數(shù)據(jù)庫收錄（CCDC編號：2048214）的3D動態(tài)模擬圖截圖[5]。
圖4 新化合物2的ORTEP圖及CCDC（編號：2048214）收錄的3D動態(tài)模擬圖截圖
4.7.其他結構確證技術
除上述結構確證方法外，還有很多其他的結構確證技術，如紅外、紫外、拉曼光譜、熱重分析（TG）、差示掃描量熱法（DSC）、旋光光譜等。
紅外光譜、熱重分析（TG）、差示掃描量熱法（DSC）、偏光顯微鏡法等對化合物晶型的判斷也可起到輔助作用。
某些化合物在固態(tài)時會表現(xiàn)出多晶型，多晶型會表現(xiàn)出紅外光譜的差異；通常，結構中微小的差別會使紅外光譜有很明顯的差別[7]。老藥組胺H2受體阻抗劑“西咪替丁”，參比制劑使用的原料藥為A晶型，其原料藥還存在另外三種晶型B、C、D，此外還有混合晶型。ABCD這四種晶型在紅外光譜中的吸收存在微小差異（見下表），根據(jù)這些差異，可采用紅外光譜來對A晶型產品進行鑒別[8]。此外，DSC也顯示A晶型和B晶型在起始熔點和最高吸熱峰存在差異，可用于晶型鑒別[9]。
表2 西咪替丁ABCD四種不同晶型的紅外吸收峰
5.總結
本文對小分子化合物的結構確證方法進行了初步匯總，實際工作中，因化合物結構和性質差異，對結構確證技術方法的選擇和應用應仔細剖析后使用。
參考資料：
[1] 化學藥物原料藥制備和結構確證研究技術指導原則（2005年）
[2] 手性藥物質量控制研究技術指導原則（2006年）
[3] 新藥 I 期臨床試驗申請技術指南（2018年）
[4] 微譜數(shù)據(jù)網（http://www.nmrdata.com/）
[5] Terpenoids from the Marine-DerivedFungus Aspergillus sp. RR-YLW-12, Associated with the Red Alga Rhodomelaconfervoides [J]. Journal of NaturalProducts, 2021, 84, 6:1763-1771.
[6] 劍橋結構數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)CSDS（https://www.ccdc.cam.ac.uk/）
[7] 中國藥典2020年版四部通則0400光譜法
[8] Bela Hegedüs, Sándor Gorog. The polymorphismof cimetidine[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,1985, 3(4):303-313.
[9] 尹華, 楊臘虎, 等. 西咪替丁的晶型研究[J]. 藥物分析雜志, 2001, 21(1):39-42.
來源：藥事縱橫
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