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嘉峪檢測網(wǎng) 2021-09-23 19:48
人源化單克隆抗體目前在腫瘤、自身免疫病、抗病毒等多個治療領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。截止目前，F(xiàn)DA已有50多種人源化抗體藥物獲批上市，人源化抗體為人類疾病的治療提供了廣闊的思路?？贵w人源化技術(shù)包括嵌合抗體技術(shù)、人源化抗體技術(shù)和全人源抗體技術(shù)，并隨之衍生出單鏈抗體、雙特異性抗體、納米抗體等多種形式的小分子人源化單克隆抗體。本文對人源化單克隆抗體技術(shù)及人源化抗體的發(fā)展形勢作一綜述。
最早的單克隆抗體（簡稱單抗）是1975年Milstein和Kohler發(fā)明的鼠源單抗［1］，雖然其具有廣闊的應(yīng)用前景，但由于恒定區(qū)可被人體免疫系統(tǒng)識別而產(chǎn)生免疫副反應(yīng)，誘發(fā)人抗鼠抗體反應(yīng)（human anti-mouse antibody reaction，HAMA）［2］，鼠源單抗的應(yīng)用有諸多限制，目前主要應(yīng)用于診斷領(lǐng)域。近年來，抗體技術(shù)的研究方向逐漸向人源方向發(fā)展［3］，迄今全球已上市的治療性抗體藥物有130多種，在抗腫瘤、抗病毒等多個領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用［4］?？贵w技術(shù)經(jīng)40多年的發(fā)展，目前已有人鼠嵌合抗體、人源化抗體及全人源單抗等［5-6］，兔源及駝源抗體也逐漸應(yīng)用于治療領(lǐng)域，同時也出現(xiàn)了不同于原始抗體結(jié)構(gòu)的抗體，如單鏈抗體、雙特異性抗體、納米抗體等，它們在傳統(tǒng)抗體的結(jié)構(gòu)上進行改進，使抗體的應(yīng)用更具有靶向性、功能性和操作性，能夠?qū)崿F(xiàn)很多傳統(tǒng)抗體所不能實現(xiàn)的功能。本文對近年來單抗人源化技術(shù)及其發(fā)展形勢作一綜述。
1 單抗人源化技術(shù)
1. 1 人鼠嵌合抗體（chimeric antibody）技術(shù)
人鼠嵌合抗體是抗體人源化進程中最早研究的抗體，是一種基因工程表達的重組抗體［7］，通過將鼠源抗體可變區(qū)基因與人源抗體恒定區(qū)基因融合表達，使其人源序列占整個抗體的70%左右，大大降低了抗體的HAMA［8］。由于不同亞型的IgG恒定區(qū)與補體和Fc受體的作用能力不盡相同，篩選得到的抗體恒定區(qū)可產(chǎn)生抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用補體依賴性的細胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）等多種功能［9］，目前應(yīng)用最多的為IgG形式的嵌合抗體。最早上市的人鼠嵌合抗體是Reopro，之后還有Sylant、Rituximab［10］、Infliximab等成功上市。
由于人鼠嵌合抗體所保留的鼠源序列較多，在進行臨床實驗時仍會被人體的免疫系統(tǒng)所識別產(chǎn)生HAMA發(fā)生，同時，由于其免疫位點的改變，致使抗體的活性降低，在實際應(yīng)用中往往需多次免疫才能達到預(yù)期效果［11］。
1. 2 人源化抗體技術(shù)
人源化抗體技術(shù)以人鼠嵌合抗體為基礎(chǔ)繼續(xù)進行改造，鼠源序列進一步減少，從而減少HAMA的發(fā)生［12］。抗體的可變區(qū)包含3個互補決定區(qū)（complementary determining region，CDR）和4個框架區(qū)（framework region，F(xiàn)R），人源化抗體通過抗體重構(gòu)、框架區(qū)重構(gòu)等技術(shù)來達到減少鼠源序列的目的。目前上市的人源化抗體有Trastuzumab、Bevacizumab、Ranibizumab、Aletuzumab等。
1.2.1 抗體重構(gòu)
抗體重構(gòu)也稱為CDR移植，與嵌合抗體不同的是，抗體重構(gòu)是將人源的FR序列克隆至抗體的相應(yīng)部位，僅保留了鼠源的CDR序列。重構(gòu)抗體的人源化程度可達90%以上，目前該方法是單抗人源化過程中最常用的方法［13］。由于重構(gòu)抗體移植區(qū)域明顯少于人鼠嵌合抗體，該抗體中異源序列的含量進一步減少，免疫原性顯著降低，臨床療效良好。但抗體重構(gòu)在實際應(yīng)用中仍存在潛在的免疫原性，因此，CDR移植的發(fā)展方向是減少不必要的CDR的引入。
1.2.2 特異性決定殘基（specificity determining residue，SDR）移植
隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)CDR區(qū)并非所有的氨基酸序列均具有免疫原性，CDR區(qū)的某些特定的氨基酸殘基可與抗原接觸，從而識別特定抗原，但還有其他氨基酸序列未參與該過程，這些與抗原接觸的氨基酸序列被稱為SDR。在構(gòu)建重組抗體的過程中，只需將SDR克隆至抗體的框架中，即可獲得目標(biāo)抗體，從而進一步降低鼠源序列［14］。
1.2.3 框架區(qū)重構(gòu)
在CDR移植過程中，對FR進行的篩選選擇與鼠源抗體序列最相似的人FR基因序列使該抗體具有更高的活性［15］。FR的修飾包括表面重塑與糖基化修飾兩方面：表面重塑即將鼠源抗體FR表面氨基酸殘基進行人源化，而這些氨基酸殘基在免疫應(yīng)答中并不能起到重要作用；糖基化修飾即改變原有的糖基化位點，從而使抗體的作用效力更高?？蚣軈^(qū)重構(gòu)可得到親和活性明顯提升的抗體，是重構(gòu)抗體中經(jīng)常用到的手段［16］。
1. 3 全人源抗體技術(shù)
人源化單抗仍具有潛在的免疫原性，而且各種氨基酸的替換需要大量的實驗，而全人源抗體的氨基酸序列均由人源抗體基因序列編碼，理論上可達到100%的人源化［17］，見圖1。目前應(yīng)用最多的全人源抗體技術(shù)有轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)和抗體庫技術(shù)［18］。目前已上市的全人源抗體有Nivoluma、Pembrolizumab、Denosumab等。
1.3.1 轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)
1994年，美國首先利用轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)人源化單抗。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)將優(yōu)化的編碼人抗體DNA序列導(dǎo)入至免疫缺陷小鼠的基因組中［19］，由于缺乏鼠源性免疫球蛋白基因，在抗原免疫后，小鼠分泌的抗體均由人抗體的DNA序列編碼，同時產(chǎn)生的抗體也不會被小鼠的免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生其抗體［20-21］。由于該抗體是在體內(nèi)產(chǎn)生，經(jīng)歷了正常的抗體裝配和成熟，從而保證了產(chǎn)生的抗體具有很高的靶結(jié)合能力。已上市的Nivolumab、Denosumab、Panitumumab 等均是由轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)的。但比較顯示，轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生的全人源單抗并沒有野生型抗體產(chǎn)生的作用明顯，另外，由于轉(zhuǎn)基因小鼠免疫系統(tǒng)仍為小鼠本身的系統(tǒng)，不能產(chǎn)生和人體完全相同的抗體。
1.3.2 抗體庫技術(shù)
抗體庫技術(shù)首先需建立抗體庫，目前有免疫抗體庫和非免疫抗體庫兩種［22］。免疫抗體庫的建立首先要通過疫苗注射等途徑進行免疫，再從體內(nèi)采集抗體，通過單細胞克隆技術(shù)等建立抗體庫［23-24］。非免疫抗體庫有半合成抗體庫、全合成抗體庫和天然抗體庫3種：半合成抗體庫是合成隨機的CDR序列；全合成抗體庫則是整個可變區(qū)完全由人工合成；天然抗體庫的抗體基因來源于未免疫個體的淋巴細胞，由于未用特異性抗原免疫，可用于多種抗原的篩選，但所得抗體由于未經(jīng)抗體親和力成熟等過程，親和力較低［25］。
1.3.2.1 噬菌體展示技術(shù)（phage dispay）
噬菌體展示技術(shù)將抗體庫中可變區(qū)基因在噬菌體表面表達，經(jīng)抗原抗體結(jié)合后，篩選出親和力最高的抗體，從而用于制備人源化單抗產(chǎn)品［26］。由于該方法是在體外篩選，更易于自動化與高通量化。體外篩選還克服了免疫耐受性，能夠篩選出識別高度保守靶點的蛋白。Necitumumab及Adalimumab等均是由噬菌體庫篩選的［27］。但庫容量的限制、宿主對氨基酸修飾的限制、細胞毒蛋白的限制等仍會影響目的蛋白質(zhì)的表達。
1.3.2.2 核糖體展示技術(shù)（ribosome display）
與噬菌體展示技術(shù)不同的是，核糖體展示技術(shù)所產(chǎn)生的抗體不會存在于噬菌體表面，而是直接在非細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達。該技術(shù)首先需利用PCR擴增目的基因DNA文庫，再導(dǎo)入一系列轉(zhuǎn)錄元件進行體外轉(zhuǎn)錄，在無細胞翻譯系統(tǒng)中進行翻譯，使靶基因的翻譯產(chǎn)物展示在核糖體表面，形成mRNA-蛋白質(zhì)-核糖體三元復(fù)合體，再向翻譯混合物中加入抗原進行篩選，以獲得親和力最高的蛋白質(zhì)。核糖體展示技術(shù)作為一種無細胞展示系統(tǒng)，經(jīng)20多年的發(fā)展，已成功應(yīng)用于體外篩選特異性結(jié)合抗體［28］。與噬菌體展示技術(shù)相比，核糖體展示技術(shù)解決了噬菌體展示技術(shù)的抗體庫容量問題，可表達包含毒性蛋白在內(nèi)的所有蛋白質(zhì)，實現(xiàn)了更高庫容量的表達。
1.3.2.3 mRNA 展示（mRNA display）技術(shù)
mRNA展示技術(shù)的原理與核糖體展示技術(shù)基本相似，不同的是，mRNA展示系統(tǒng)翻譯出來的蛋白是與mRNA通過接頭連接在一起的，由于無核糖體的存在，更有利于篩選，而核糖體展示由于mRNA、多肽和核糖體三位一體，可能會影響接下來的篩選，丟失部分抗體，同時，由于其結(jié)合的不穩(wěn)定性，很有可能導(dǎo)致篩選失?。?9］，因此，mRNA展示技術(shù)是核糖體展示技術(shù)的改良與延伸。
1.3.2.4 酵母展示技術(shù)（yeast display）
酵母展示技術(shù)利用酵母作為載體，將外源基因通過融合表達的形式定位至酵母細胞表面，從而展現(xiàn)出最完整的蛋白結(jié)構(gòu)以進行篩選。酵母作為一種真核生物，既能實現(xiàn)蛋白表達過程中的翻譯后修飾過程，又能將蛋白的表位完全呈現(xiàn)出來，還可通過熒光素等標(biāo)志物標(biāo)記酵母細胞，繼而利用流式細胞術(shù)進行實時和定量篩選。
1.3.2.5 單細胞技術(shù)
隨著基因測序技術(shù)及流式細胞術(shù)的發(fā)展，近年來單細胞技術(shù)研究火熱，在人源化抗體領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。該技術(shù)可從建立好的抗體庫內(nèi)根據(jù)細胞表面標(biāo)記分子篩選出單個細胞，細胞富集后利用RT-PCR直接獲得抗體的重鏈和輕鏈基因［30］。免疫過疫苗的人外周血抗體庫篩選出來的高特異性抗體可用來制備全人源抗體，免疫過疫苗的兔脾臟可用來篩選兔源單抗，經(jīng)抗體人源化后即可應(yīng)用于人體，Brolucizumab為全球首個獲批的兔源單抗［31］。
綜上所述，抗體庫技術(shù)徹底改變了單抗的制備方法，擺脫了對鼠源細胞的依賴，產(chǎn)生的抗體完全人源化，是當(dāng)下研究的熱點。
2 新型抗體
隨著抗體技術(shù)的發(fā)展，抗體的結(jié)構(gòu)也不僅局限于最原始的結(jié)構(gòu)，逐漸發(fā)展出單鏈抗體、雙特異性抗體、納米抗體以及以DNA編碼的單抗等。目前已有多種不同類型的人源化單抗上市。
2. 1 單鏈抗體（single-chain Fv）
單鏈抗體由于不含抗體恒定區(qū)，其相對分子質(zhì)量要小于正常的抗體，同時也失去了與Fc 受體結(jié)合的功能，但也因此，其可塑性非常強，可與多種分子結(jié)合，從而介導(dǎo)不同的殺傷作用，如制備靶向作用的“生物炮彈”、抗體融合蛋白［32］、抗體-藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugate，ADC）［33］等，同時，由于其相對分子質(zhì)量小，產(chǎn)生HAMA的幾率非常低［34］，已上市的單鏈抗體有Bren-tuximab vedotin 和Ado-trastuzumabemtansine等。單鏈抗體人源化的技術(shù)有多種，以噬菌體展示和核糖體展示技術(shù)最為常用，鼠源抗體經(jīng)蛋白質(zhì)測序后進行CDRs移植的方法也有文獻報道［35］。但單鏈抗體也存在抗原性弱、效果不穩(wěn)定的缺點，在實際應(yīng)用中往往存在諸多限制。
2. 2 雙特異性抗體（bispecific antibody）
雙特異性抗體的可變區(qū)含有兩種不同抗原的結(jié)合位點［36-37］，這兩種結(jié)合位點可以是分別與效應(yīng)細胞和腫瘤細胞結(jié)合的，從而激發(fā)出具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)［38-39］，也可以是靶向兩種腫瘤位點的，以減少用藥量以及臨床審批的步驟，也會起到更強的免疫作用。目前雙特異性抗體制備最常規(guī)的手段是基因工程方法，也可利用兩種雜交瘤細胞融合、化學(xué)偶聯(lián)法等方法制備［40］，現(xiàn)已成為抗體工程領(lǐng)域研究的熱點，在腫瘤治療及抗病毒領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［41］。同時靶向CD19和CD3的Blinatumomab以及治療血友病的Emicizumab均為該類抗體藥物［42］。
2. 3 納米抗體（nanobody）
納米抗體是1993年最早從羊駝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗體，其天然缺失輕鏈和CH1恒定區(qū)。由于其相對分子質(zhì)量小，體內(nèi)組織滲透性好，可很輕易地穿過血管到達靶標(biāo)。天然的羊駝納米抗體與人源抗體相比，其氨基酸殘基差別并不大。目前已有利用噬菌體展示技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)制備全人源化納米抗體的報道。針對von Willebrand因子的Caplacizumab-Yhdp作為全球首個獲批的納米抗體藥物，為納米單抗藥物的研發(fā)提供了廣闊的前景。由于目前上市的產(chǎn)品較少，未來納米抗體的長期使用是否會產(chǎn)生免疫副反應(yīng)仍需觀察。
2. 4 DNA 編碼的單抗（DNA-encoded monoclonal antibody，dMAb）
DNA編碼的單抗是新興起的一種全人源單抗技術(shù)。與當(dāng)前常規(guī)治療性抗體不同，其是在人體內(nèi)產(chǎn)生，而并非在體外合成。與DNA疫苗類似，dMAb首先需構(gòu)建出一種序列優(yōu)化的質(zhì)粒，用于編碼一種單抗，借助CELLECTRA誖等公司的電穿孔技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至人體內(nèi)，使該單抗基因在人體中表達。dMAb可進行序列優(yōu)化，從而使抗體在體內(nèi)表達量顯著提升，刺激強大的CD8+T細胞浸潤，同時還能保持以往的抗原抗體結(jié)合能力。dMAb技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，當(dāng)前現(xiàn)有的人源化單抗均可由基因編碼后在人體內(nèi)表達，是一種抗體全人源化的全新手段。dMAb技術(shù)由于興起較晚，目前還處于研發(fā)階段，暫時無上市的單抗［43］。
3 國內(nèi)外抗體藥物發(fā)展趨勢
目前國外人源化單抗的生產(chǎn)以創(chuàng)新為主，全球已有80多種單抗類藥物獲批上市，其中美國食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)50多種。截至2019年5月，國內(nèi)共批準(zhǔn)單抗藥品36個，其中國產(chǎn)14個，進口22個，與美國差距明顯。隨著多種原研單抗藥物的專利到期，近年來國外生物類似藥獲批數(shù)量也逐漸增多，呈井噴式發(fā)展。截止目前，歐盟已有17種單抗類生物類似藥獲批上市，美國已有10種。最早獲批上市的生物類似藥是歐盟2013年批準(zhǔn)的英夫利西單抗，2016年，美國安進公司（Amgen）阿達木單抗的生物類似藥AMJEVITA在美國食品藥品監(jiān)督管理局獲批上市，這也是阿達木單抗首個獲批的抗體生物類似藥。國內(nèi)人源化單抗由于起步較晚，研發(fā)水平與發(fā)達國家存在較大差距，目前以進口藥為主，但自研藥以及生物類似藥的研究也發(fā)展迅速。2015年2月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局正式頒布《生物類似藥研發(fā)與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行），規(guī)范了生物類似藥的申報程序、注冊類別和申報資料等相關(guān)注冊要求，為生物類似藥的研發(fā)提供了基本指導(dǎo)和依據(jù)。在政府的大力支持及行業(yè)和市場的合力驅(qū)動下，國內(nèi)的生物類似藥研究呈指數(shù)上升趨勢，靶點主要集中在CD20、EFGR、VEGF、TNF和HER2，包括阿達木單抗、貝伐單抗、曲妥珠單抗、利妥昔單抗及英夫利昔單抗等在內(nèi)的多種專利已過期或即將過期的原研單抗藥物成為國內(nèi)藥企爭先研發(fā)的熱點。2019年2月，由上海復(fù)宏漢霖生物技術(shù)股份有限公司研發(fā)的首個國產(chǎn)利妥昔單抗生物類似藥漢利康誖上市，意味著在生物類似藥開發(fā)領(lǐng)域，我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)已處在從“跟跑歐美”轉(zhuǎn)向“與歐美并跑”的關(guān)鍵節(jié)點。
4 展望
近年來，在全球批準(zhǔn)的新藥中，人源單抗類藥物所占比例越來越大，可見人源單抗具有很高的應(yīng)用價值，為腫瘤、自身免疫性疾病等多種疾病的治療提供了新的思路。雖然抗體人源化后理論上能降低HAMA，但目前尚無法完全消除，越來越多的報道顯示，人源化抗體在應(yīng)用過程中仍可產(chǎn)生HAMA［44］，因此，合理運用上述方法和技術(shù)創(chuàng)新，在原有的基礎(chǔ)上減少抗體異源性，不斷提高抗體的親和力，開發(fā)出針對全新靶點的人源抗體，是抗體藥物發(fā)展的必由之路，必將為新藥開發(fā)開辟新的道路。另一方面，隨著生物類似藥的逐漸上市，未來以外企為主的競爭格局將逐漸被打破，鑒于生物類似藥較原研藥具有明顯的價格優(yōu)勢，加上國家醫(yī)保政策的強力支持，生物類似藥將更好、更廣泛地惠及患者，對醫(yī)療大健康產(chǎn)業(yè)持續(xù)性地產(chǎn)生積極影響。
來源：中國生物制品學(xué)雜志
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