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前言

 

隨著液相的普及，紫外可見分光光度計（UV）的使用頻率在逐漸下降。十年前，UV大量用于溶出度和含量的測定。尤其是溶出度的測定，藥典中收載了大量用UV測定溶出量的品種。目前，UV大都僅用作定性鑒別了，但其在某些特殊情況下仍有著不可替代的作用。

 

UV測定的優(yōu)缺點：

 

如有輔料或是其他組分的存在，UV在某個波長下測定的是組分的疊加信號，不能區(qū)分開，而HPLC卻能很好地將輔料或其他干擾組分在色譜柱上分離開，這種定量測定專屬性差的缺點制約了UV的發(fā)展。但是正是這個缺點有時可能成為優(yōu)點，例如利用這個“優(yōu)點”可測定易降解化合物的疊加響應來計算藥物的溶出度。

 

此外，一些溶出儀與UV聯用在線測定溶出量，甚至誕生了光纖溶出儀；UV測定的成本相對HPLC也低很多。因此，UV還是有它用武之地的。在利用UV進行固體制劑溶出度和含量的定量測定時，輔料的干擾成了難以繞開的障礙。本文就筆者的相關經歷并結合理論和文獻，談一談UV測定時消除輔料干擾的一些技巧。

 

1繞開輔料吸收較強的波段

 

這是UV測定時消除輔料干擾的最簡易方法，如能用此法解決干擾問題，那最省事了。具體步驟如下：

 

分別將制劑中處方比例的主藥和空白輔料配制成合適濃度的溶液，在一定波長范圍內（如200nm～400nm）掃描得光譜圖。

 

查看輔料和主藥的光譜圖，一般輔料在低波段的吸收均較大（250nm之前），從此波長往后找，看能否找到輔料的吸收幾乎沒有（貼近零線）而主藥的吸收仍然較大的波長。如果此波長是主藥的吸收峰，那更好了。如果不是吸收峰，較平坦處也行。前兩者都不是，在陡坡處的波長也能勉強測定，現在UV儀的波長精度較好，誤差不會太大。

 

一般溶出度測定時的輔料干擾控制在2%以內即可，當然越逼近零越好。

 

在此，順便說一下，為何定量測定時要選擇最大吸收波長處，HPLC也是如此，因為在最大吸收波長處，吸收最大且光譜較光滑平坦，斜率幾乎為零，若因波長的精度問題輕微波動，不會引起吸收度的較大誤差。而在陡坡處，斜率較大，波長的輕微誤差就會引起吸收度的較大變化。不過現在的UV儀器，波長準確度能控制在0.2nm左右，這種波長誤差引起的吸收度誤差大可不必擔心。

 

 

2雙波長等吸收差值法

 

此法需要滿足一定的條件才適用，具體條件和步驟如下：

 

分別將制劑中處方比例的主藥和空白輔料配制成合適濃度的溶液，在一定波長范圍內（如200nm～400nm）掃描得光譜圖。

 

查看主藥和空白輔料的光譜圖。如主藥在λ2有較大吸收，吸收度為A1（λ2），在此波長處輔料也有吸收，為A2（λ2）。

 

查看輔料的光譜圖。輔料光譜圖上有無與A2（λ2）等吸收的波長，如有，假設為A2（λ1），而且在此波長處主藥幾乎沒有吸收。

 

測定時，采用雙波長測定，λ1和λ2，計算兩個波長處的差值。假設在λ2處主藥和輔料的總吸收度為A（λ2）。

 

A（λ2）= A1（λ2）+ A2（λ2）

 

其中A2（λ2）= A2（λ1），代入上式

 

A（λ2）= A1（λ2）+ A2（λ1）

 

A（λ2）- A2（λ1）=A1（λ2）

 

如此，求得的差值A（λ2）- A2（λ1）就是主藥在λ2處的吸收度A1（λ2）。此法測定必須符合兩個基本條件：1）干擾組分輔料在這兩個波長應具有相同的吸收度；2）待測組分在這兩個波長處的吸收度差值應足夠大，即主藥在λ2處的吸收度較大，而在λ1處幾乎沒有吸收。大部分品牌的UV工作站都能進行雙波長測定，如島津的UVprobe和安捷倫的21CFR紫外工作站，有的還能直接讀出雙波長間的差值。所以如能滿足上述條件，測定過程也相當簡便，主要是能很好地消除輔料的干擾。下圖雖不是實際案例，但通過此示意圖能方便理解。

 

 

3導數光譜法

 

此法聽起來似乎很玄乎，其實理解之后，也并不復雜，筆者曾經接觸過這樣的案例，如某片進口注冊標準中的溶出度測定就是用的導數光譜法，其目的是利用導數光譜法消除片中的輔料干擾。導數光譜的定量原理：

 

 

從上式一階導函數中，可以看出一階導數與樣品濃度仍然成線性關系。同理，二階導數和三階導數等高價導數也與樣品濃度成線性關系。注意，這里是對光譜函數的導數，得到導數函數，而不是吸收度的導數，吸收度值是一常數，求導后為零。

 

利用導數光譜法消除輔料干擾的要求和步驟如下：

 

分別將制劑中處方比例的主藥和空白輔料配制成合適濃度的溶液，在一定波長范圍內（如200nm～400nm）掃描得光譜圖。

 

查看主藥和空白輔料的光譜圖。將這兩個光譜圖分別轉換成導數光譜圖，島津的UVprobe和安捷倫的21CFR紫外工作站都有此功能。在轉換導數光譜時需要設置Δλ值，該值可選擇默認值也可根據需要選擇合適值。

 

查看主藥和輔料光譜圖經轉換后的導數光譜圖。對應于主藥導數光譜圖中的波峰或波谷處，輔料導數光譜圖是否幾乎沒有吸收（越貼近零線越好），一般情況下，輔料光譜圖經一階導數轉換后，原來輕微的干擾會消失殆盡。如一階導數后，輔料還是有較大干擾，可再經二階導數或三階導數轉換。

 

定量測定時，采用導數光譜上適宜的振幅作為定量參數，而不再稱作吸收度了。常用的方法有峰谷法和峰零法。峰谷法是測量兩相鄰峰谷之間的垂直距離，峰零法是峰或者谷到零線之間的垂直距離。

 

方法確定后，在正式測定進行光譜掃描時，掃描的波長范圍可適當縮小，如250nm～300nm,這樣可節(jié)約掃描時間。

 

 

結語

 

上述提及的幾種方式，可根據實際需要選擇，能簡則簡，解決干擾問題就行。其實還有其他更為復雜的方式，沒有必要進一步折騰。UV法如用得好用得熟練，能大大節(jié)約成本，有時還能彌補HPLC的不足。當然，隨著HPLC和UPLC的快速發(fā)展，UV法只能作為配角了，主角和配角都使用恰當，事情會做得更好。本文僅代表個人觀點，如有不當，還請各位同仁多多包涵。

 

參考文獻

 

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