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一、梯度洗脫的原理

典型的梯度洗脫是用兩種溶劑做流動相，弱溶劑A和強溶劑B，在反相色譜分離中溶劑A大都是水，溶劑B是甲醇或者乙腈等強溶劑。所有的梯度洗脫中溶劑強度不斷增加，即B的濃度不斷增加。例如，流動相中溶劑B的含量在一定時間內(nèi)梯度從20%提高到80%。梯度控制器決定流動相的組成，可通過輸入不同的條件實現(xiàn)：①流動相(梯度洗脫開始時): cB(%)；②流動相(梯度洗脫結(jié)束時): cB(%)；③從分離開始到結(jié)束的梯度時間;④ 梯度形狀;⑤流速。

梯度洗脫常用于分離極性范圍廣的組分，最后一個峰的等度保留必須大于第一個峰。在等度分離中，第一個峰與最后一個峰的k'比應(yīng)大于30，這樣用梯度才有好的結(jié)果。用等度分離在色譜圖中前面的峰擠在一起，后面的峰又拉得很開（圖a)。用梯度洗脫峰間的位置很平均，分離度好，后面的峰很窄，檢測方便（圖b)。在等度洗脫中前面峰的k'值很小，后面峰的k'很大，梯度洗脫使流動相強度不斷變化改變了k'值。在梯度洗脫中，弱保留組分在弱流動相中首先離開色譜柱，而強保留組分在強流動相中最后離開色譜柱。

(a)梯度洗脫：甲醇-水，甲醇濃度從10%至100%；

(b)等度洗脫，甲醇-水，體積比=50:50；

1-苯；2-氯苯；3-對-二氯苯；4-1,2,3-三氯苯；5-1,3,5-三氯苯；6-1,2,4-三氯苯；7-1,2,3,4-四氯苯；8-1,2,4,5-四氯苯；9-四氯苯；10-六氯化苯

如果CB開始太大，先出來的峰分得不好，是開始出的峰k'太小。如果先出來的峰擠在一起，應(yīng)把開始的CB降下來。以最終CB值控制最后的峰的洗脫時間。

開始試驗時很可能有一對或更多的峰未完全分開，就像等度分離那樣。也應(yīng)該像改善等度分離那樣改善梯度的分離度，可以優(yōu)化k'、N和α。雖然初接觸時不太適應(yīng)梯度洗脫模式，但實際上它比等度洗脫更為方便容易。用這種模式的主要困難是，選定依賴于開始和最后CB的k'值、梯度時間tG、柱體積Vm以及流速F。它們的關(guān)系如下：

梯度洗脫中，k'視為常數(shù)，在反相液相色譜中大約等于20, △CB(%)為最終的cB(%)減去開始的cB(%)。柱體積等于FtG(150mmX0.46cm柱大約1.5mL)。增加梯度時間和流速，減少柱長和梯度變化范圍就增加k'。在梯度洗脫中，增加k'就可獲得與等度分離相同的結(jié)果：寬峰、較長的分離時間、良好的分離度。

在梯度洗脫中增加N值也可增加分離度，用較長的柱、高效柱或減少流速可增加N值。根據(jù)上式改變柱長和流速會影響到k'。增加N值會導(dǎo)致較小的是k'值，從分離度方面考慮會有相反的作用。在梯度洗脫中增加N可以保持是k'值恒定。改變F或柱長，保持tGF/Vm恒定，則k'也會恒定。

二、梯度洗脫出現(xiàn)的問題

總體講，梯度洗脫中所出現(xiàn)的故障與等度洗脫非常類似,主要包括以下方 面：第一是與儀器故障實驗技術(shù)、色譜柱故障等有關(guān)；第二是由于試驗條件不當(dāng)設(shè)置導(dǎo)致分離方面問題(分離度差、寬峰等）。下表匯總了梯度洗脫常見故障及解決方法。

（1）基線漂移 如果B溶劑（甲醇）比A溶劑（水）吸收大，梯度洗脫時基線上升，在低紫外波長檢測更加厲害。一個解決的辦法是加有紫外吸收的組分到A或B溶劑中，以均衡兩種溶劑的吸收。加紫外吸收劑的一個要求是在梯度洗脫條件下無保留。也可加氧化亞氮在A(水）中。在185nm?200nm 處檢測常加低濃度的硝酸鹽；在高檢測波長加周期表中高族的鹽（如溴酸鹽、 高碘酸鹽）。

（2）偽峰 在流動相中存在有紫外吸收的雜質(zhì)，用梯度洗脫能分離出來，即不進(jìn)相關(guān)的樣品也照常出峰。如用普通的蒸餾水或含有雜質(zhì)的溶劑就會不斷出峰或基線漂移，建議用HPLC級的水和溶劑。

（3）溶劑分層 在梯度洗脫中用硅膠柱最易出現(xiàn)這種現(xiàn)象。若B溶劑活性很強（如丙醇），A溶劑極性很弱（如正己烷）。在梯度初始階段B溶劑被柱所吸收，繼續(xù)梯度B溶劑就打破平衡?？赡茉谏V圖上某些點分離度明顯降低，個別峰特別窄，而兩側(cè)峰又比較寬。在窄峰這一點上，正好B溶劑破壞了平衡，然后又分層。分析時要注意選用對B溶劑吸收低的柱，用鍵合相的柱很少發(fā)生這種現(xiàn)象。

溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相，有些溶劑在一 定比例內(nèi)混溶，超出范圍就不互溶，使用時更要引起注意。當(dāng)有機溶劑和緩沖液 混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。

三、梯度滯后體積

梯度滯后體積是指從溶劑配比完成點到色譜柱頭的系統(tǒng)體積，也可稱為延緩體積，相當(dāng)于在梯度運行之前運行一段等度條件。下圖是低壓梯度與髙壓梯度 系統(tǒng)中滯后體積的示意圖。

滯后體積的差異是造成梯度重現(xiàn)性差和方法傳遞困難的根源之一。系統(tǒng)體積較大時，由于梯度的譜帶展寬作用，會改變預(yù)期的梯度形狀，使得不同HPLC系統(tǒng)之間難以進(jìn)行方法轉(zhuǎn)換。下圖是理想情況下和不太理想的梯度滯后曲線的示意圖。

傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)滯后體積一般在0.5mL?5mL范圍，通常采用4.6mm內(nèi) 徑，150mm或更長的色譜柱，分析時間10min?20min之間或更長時，滯后體積的影響并不顯著。但是隨著柱長變短、內(nèi)徑變細(xì)，較大的滯后體積可能會引起保留時間明顯增加，色譜分離情況發(fā)生變化，因此，當(dāng)用細(xì)內(nèi)徑色譜柱進(jìn)行分離時，滯后體積太大會引起梯度變化的延遲。