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摘 要：紫杉醇類化合物屬二萜類生物堿，是已知療效最好的植物源抗腫瘤藥物之一。目前，工業(yè)上主要依賴半化學(xué)合成、植物提取及細(xì)胞培養(yǎng)等途徑大規(guī)模獲取紫杉醇類產(chǎn)物。針對(duì)主流方法存在的問題，重點(diǎn)分析獲取紫杉醇類活性產(chǎn)物的研發(fā)動(dòng)向，探討采用紅豆杉樹皮細(xì)胞培養(yǎng)、內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)現(xiàn)狀與困境，簡(jiǎn)要梳理紫杉醇的天然合成途徑，討論采用合成生物學(xué)方法異源合成紫杉醇及其前體的可能性，為建立綠色、可持續(xù)的紫杉醇類活性產(chǎn)物生產(chǎn)路線提供參考。

紫杉醇類化合物是以紫杉醇（paclitaxel）、多烯紫杉醇（docetaxel）為代表，結(jié)構(gòu)具有紫杉烷骨架的一系列天然產(chǎn)物及衍生物。此類物質(zhì)抗腫瘤機(jī)制獨(dú)特，主要通過增強(qiáng)微管纖維蛋白聚合，使有絲分裂停止于G2/M期，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。紫杉醇屬二萜類生物堿，最早由美國科學(xué)家Wani和Wall于1967年從太平洋紫杉，即短葉紅豆杉Taxus brevifolia Nutt. 樹皮分離獲得[1]。隨后經(jīng)20多年的臨床研究，紫杉醇注射液（商品名Taxol®）于1992年上市，目前累計(jì)銷售已超145億美金。1996年，與其結(jié)構(gòu)僅相差2個(gè)基團(tuán)的多烯紫杉醇（商品名Taxotere®）通過評(píng)審，后者在生物利用度、滯留時(shí)間、細(xì)胞內(nèi)濃度及抗腫瘤活性等方面均明顯優(yōu)于前者，可用于晚期乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌及胃腺癌等多種惡性腫瘤的治療[2-4]。2010年，多烯紫杉醇的7,10-二甲醚產(chǎn)物卡巴他賽（Cabazitaxel，商品名Jevtana®）獲批，隨即成為治療晚期前列腺癌的一種重要二線藥物。

早期，紫杉醇類藥物使用聚氧乙烯蓖麻油及聚山梨酯-80等輔料，會(huì)刺激機(jī)體釋放組胺引起過敏反應(yīng)。隨后的多種改良劑型可有效降低不良反應(yīng)，從而逐步占據(jù)了主要市場(chǎng)份額。2003年上市的脂質(zhì)體包埋型劑型力樸素（商品名Lipusu®）是全球首個(gè)紫杉醇改良劑型。2005年，Celgene公司的白蛋白結(jié)合型紫杉醇Abraxane®獲批，該劑型以人源白蛋白為載體，自上市以來銷售逐年穩(wěn)步增長(zhǎng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球紫杉烷類藥物年銷售約50億美元，其中Abraxane單品占比即高達(dá)1/5（2018年銷售額10.62億美金）。相比而言，我國同類產(chǎn)品的年銷售額約51億元，其中以力樸素銷量最為突出（2017年銷售21.7億元）。2018年，隨著石家莊制藥集團(tuán)有限公司和江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司的白蛋白結(jié)合型仿制藥先后上市，進(jìn)一步充實(shí)了我國的紫杉醇類制劑品種，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)也愈加激烈。

目前，獲取紫杉醇類原料藥主要依賴植物提取，化學(xué)/半化學(xué)合成及生物合成3種途徑。作為療效最好的抗腫瘤天然產(chǎn)物之一，紫杉醇最初源于短葉紅豆杉的樹皮提取物，后逐漸開發(fā)出從針葉中提取具有紫杉烷骨架且含量更高的結(jié)構(gòu)類似物，再借助化學(xué)修飾的大規(guī)模生產(chǎn)方法。多烯紫杉醇便是在衍生化研究中獲得的半合成抗腫瘤藥物。然而，現(xiàn)行的植物提取及半化學(xué)合成方法均嚴(yán)重依賴于自然資源或種植業(yè)。利用綠色環(huán)保、可持續(xù)生產(chǎn)的生物合成策略則有望徹底解決紫杉醇類活性產(chǎn)物的供需矛盾，對(duì)于天然產(chǎn)物的生產(chǎn)研究具有前瞻性戰(zhàn)略價(jià)值。

1  現(xiàn)行紫杉醇獲取途徑

1.1  植物提取與化學(xué)合成

從紅豆杉分離提取是早期獲取紫杉醇的主要途徑。紅豆杉屬共15種[5]，包括短葉紅豆杉、歐洲紅豆杉T. baccataL.、東北紅豆杉T.cuspidata S. et Z. 等，但含量普遍較低，即便是公認(rèn)最高的短葉紅豆杉內(nèi)層樹皮，也僅含0.069%的紫杉醇。利用現(xiàn)行工藝，可從1kg干樹皮提取約0.1～0.5 g紫杉醇[6]，然而腫瘤患者單個(gè)療程即消耗達(dá)2 g，理論上至少需采集4～8棵生長(zhǎng)超50年的野生紅豆杉樹皮。據(jù)保守估算，2018年全球紫杉醇原料藥產(chǎn)量已突破2000 kg，如單純依靠植物提取，實(shí)難滿足持續(xù)增長(zhǎng)的臨床用藥需求。

利用化學(xué)合成是緩解天然產(chǎn)物供應(yīng)不足的常用策略。紫杉醇化學(xué)名為5β,20-環(huán)氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13 [(2′R,3′S)-N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸酯]，結(jié)構(gòu)新穎而復(fù)雜。雖然早在1994年就已建立多條全合成方法，但由于路線長(zhǎng)、產(chǎn)率低、成本高昂等原因，已有方案均未能應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)[7]。利用人工培育的紅豆杉針葉提取與紫杉醇結(jié)構(gòu)類似的前體，如巴卡亭Ⅲ（baccatine III）、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatinIII，10-DAB）等，經(jīng)幾步催化，也可規(guī)?；a(chǎn)（多烯）紫杉醇[8-9]。由于半化學(xué)法使用的前體含量較高（約0.1%）、提取于可再生資源、產(chǎn)物純度高等，其產(chǎn)量目前已占世界總產(chǎn)量的近2/3。然而半合成路線至少需經(jīng)35步反應(yīng)，最高產(chǎn)率僅為0.4%，所使用的前體仍源于人工種植提取，從本質(zhì)上并未徹底解決紫杉醇原料供應(yīng)的難題。

1.2  樹皮細(xì)胞培養(yǎng)

通過培養(yǎng)紅豆杉樹皮細(xì)胞生物合成紫杉醇，無需引入外源基因，可避免外源酶催化產(chǎn)物造成的細(xì)胞毒性，是一條無需消耗天然紅豆杉資源、不依賴土壤種植的綠色生產(chǎn)方法。在商業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，意大利Indena公司最早采用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇原料藥，而美國PythonBiotech公司是同類工藝的領(lǐng)頭公司，年產(chǎn)超100 kg。然而樹皮細(xì)胞的紫杉醇初始產(chǎn)量過低，同時(shí)由于對(duì)調(diào)控機(jī)制的解析不夠、缺乏高效的操作工具等，很難使用常規(guī)的代謝工程策略大幅提升紫杉醇產(chǎn)率。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化、添加誘導(dǎo)因子等方法則可在一定程度上改善樹皮細(xì)胞產(chǎn)量。2013年，Han等[10]研究證實(shí)，攪拌式發(fā)酵的剪應(yīng)力會(huì)破壞合成巴卡亭III及紫杉醇的上游中間體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）的環(huán)化，影響巴卡亭III及紫杉醇產(chǎn)率，故使用氣升式發(fā)酵可能更有利于產(chǎn)物合成。此外，培養(yǎng)溫度也會(huì)顯著影響紫杉醇產(chǎn)量，當(dāng)溫度為24 ℃時(shí)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)；而當(dāng)溫度升高至29 ℃時(shí)，細(xì)胞則表現(xiàn)出加速合成紫杉醇的狀態(tài)[11]。

另一方面，通過向培養(yǎng)體系添加誘導(dǎo)子，增強(qiáng)上游基因表達(dá)，也可促進(jìn)紫杉醇的生產(chǎn)。生長(zhǎng)素、脫落酸和細(xì)胞分裂素等植物激素以及茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）等常被作為誘導(dǎo)子調(diào)節(jié)植物次生代謝效率[12]。JA可通過調(diào)節(jié)多種生物堿合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，影響產(chǎn)物產(chǎn)率[13]，其甲酯形式茉莉酸甲酯（MeJA）是參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信號(hào)分子[14]。通過向紅豆杉樹皮細(xì)胞培養(yǎng)體系添加MeJA，上游途徑的紫杉二烯合成酶（taxadienesynthase，TS）、紫杉烷-10β-羥基化酶（taxoid 10β-hydroxylase，T10βH）及10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶（10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase，DBAT）等基因表達(dá)顯著增強(qiáng)[15-16]，從而可顯著提高紫杉醇的產(chǎn)量。

2  紫杉醇的合成代謝通路

紫杉醇為三環(huán)二萜類化合物，結(jié)構(gòu)稍顯復(fù)雜，其合成通路可分為3個(gè)典型階段（圖1）：（1）紫杉烷環(huán)狀母核結(jié)構(gòu)的形成，階段產(chǎn)物為巴卡亭III；（2）苯基異絲氨酸側(cè)鏈的合成；（3）側(cè)鏈與母核?；B接，再經(jīng)側(cè)鏈修飾形成紫杉醇[17]。

利用乙酰輔酶A為出發(fā)原料，通過胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑（mevalonic acid pathway，MVA），或以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸為出發(fā)原料，通過甲基赤蘚醇磷酸途徑（methylerythritolphosphate，MEP）經(jīng)6～7步反應(yīng)，可合成異戊烯焦磷酸（isopentenylpyrophosphate，IPP）。IPP在對(duì)應(yīng)的異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）的催化下，轉(zhuǎn)化成其異構(gòu)體甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyldiphosphate，DMAPP）。DMAPP與IPP經(jīng)法尼基焦磷酸合成酶（farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PPS）催化縮合，可依次形成牻牛兒基焦磷酸（geranylpyrophosphate，GPP）、法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP），再經(jīng)牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（geranyl geranyldiphosphate synthase，GGPPS）催化，即可得GGPP。

GGPP是紫杉烷類產(chǎn)物生物合成的直接前體，大約再經(jīng)19步催化反應(yīng)，即可生成紫杉醇[18]。首先，GGPP經(jīng)TS催化，環(huán)化形成紫杉二烯 [taxa- 4(5),11(12)-diene]，此為紫杉烷二環(huán)二萜骨架合成的第一步反應(yīng)。隨后，紫杉二烯在細(xì)胞色素P450單加氧酶（CYP）的催化下，分別在C5、C10、C2、C9、C13、C7及C1等碳位發(fā)生羥基化[19]，繼而，C2、C5及C10位羥基進(jìn)一步發(fā)生?；?，C9位羥基酮基化，以及形成4,5-環(huán)氧丙烷環(huán)等，即可生成核心前體巴卡亭III[20]，此為現(xiàn)行半化學(xué)合成工藝的出發(fā)原料。需注意的是，羥基化及?；炔⒎前垂潭ǖ捻樞蛳群蟀l(fā)生，某些?；磻?yīng)的發(fā)生也可早于其他碳位的羥基化[21]。截止目前，已有包括C5[22]、C10[23]、C13[24]、C7[25]、C2[26]及C9[27]位在內(nèi)的至少6種羥基化酶基因被克隆與鑒定。

紫杉烷類產(chǎn)物C13位的苯基異絲氨酸側(cè)鏈，是賦予其高效抗癌活性的核心因素。α-苯丙氨酸受對(duì)應(yīng)的變位酶（phenylalanineaminomutase，PAM）催化[28]，異構(gòu)化為β-苯丙氨酸，再結(jié)合乙酰-CoA，生成β-苯丙氨酸-CoA。隨后，經(jīng)相應(yīng)?；D(zhuǎn)移酶（3-amino-3-phenylpropanoyltransferase，BAPT）催化[29]，β-苯丙氨酸-CoA與巴卡亭Ⅲ C13位羥基?；B接，生成β-苯丙胺?；?巴卡亭Ⅲ（β-phenylalanyl-baccatinⅢ），再經(jīng)進(jìn)一步的側(cè)鏈羥基化，形成3′N-去苯甲酰紫杉醇（3′N- debenzoyltaxol）。最后，經(jīng)3′N-去苯甲酰-2′-脫氧紫杉醇-N-苯甲?；D(zhuǎn)移酶（3′-N-debenzoyl-2′- deoxytaxol-N-benzoyltransferase，DBTNBT）催化，3′N-去苯甲酰紫杉醇側(cè)鏈C3′位的N發(fā)生苯甲?；?，即可生成紫杉醇[29]。

3  潛在的紫杉醇獲取途徑

3.1  內(nèi)生真菌培養(yǎng)

從紅豆杉樹皮分離可自主產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌[30-31]理論上可更快速、規(guī)?；墨@得此天然產(chǎn)物。自1993年以來，累計(jì)已分離鑒定60株以上的相關(guān)內(nèi)生真菌[32]。由加拿大Novo Pharma公司分離的Alternaria alternate，經(jīng)培養(yǎng)優(yōu)化后，紫杉醇最高產(chǎn)量可達(dá)243.8 mg/L[33]，顯示出極高的投產(chǎn)價(jià)值。然而，由于內(nèi)生真菌與紅豆杉之間的種屬差異，已解析的催化酶及調(diào)控機(jī)制無法套用于針對(duì)內(nèi)生真菌的代謝改造，因此有必要獨(dú)立解析其特有的合成途徑。近期，Miao等[34]通過測(cè)序注釋紫杉醇產(chǎn)生菌Cladosporium cladosporioides MD2，挖掘到9個(gè)可能參與萜類骨架合成的單基因，40個(gè)可能參與從GGPP合成10-DAB的功能基因，為揭示內(nèi)生真菌的紫杉醇合成途徑提供了重要信息。利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)紫杉醇具有周期短、條件可控、成本低廉等眾多優(yōu)勢(shì)[35]，可穩(wěn)定、規(guī)?；孬@取紫杉醇或關(guān)鍵前體，然而盡管相關(guān)研究已開展30余年，至今卻未見產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的報(bào)道。可預(yù)料的是，未來如能實(shí)現(xiàn)通過培養(yǎng)內(nèi)生真菌直接生產(chǎn)紫杉醇類產(chǎn)物，其供需失衡問題必將隨之解決。

3.2  利用合成生物學(xué)生產(chǎn)紫杉醇

基于合成生物學(xué)理念，通過植入關(guān)鍵的催化基因/途徑，重構(gòu)對(duì)接底盤細(xì)胞的代謝通路，理論上可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜產(chǎn)物的異源生物合成。利用底盤細(xì)胞的MEP途徑或MVA途徑等，提供IPP及DMAPP等基礎(chǔ)原料，借助外源引入的關(guān)鍵酶催化，即可打通紫杉醇或其中間體的異源合成通路。近些年，利用大腸桿菌、釀酒酵母為代表的微生物底盤由于操作簡(jiǎn)便、易規(guī)?；囵B(yǎng)等因素，相關(guān)研究較為豐富，而利用煙草等植物底盤表達(dá)植物源CYP具有顯著的兼容性優(yōu)勢(shì)，也已成為一條頗具前景的研究方案。

3.2.1  利用微生物底盤合成紫杉醇前體  大腸桿菌生長(zhǎng)迅速，代謝通路簡(jiǎn)單清晰，基因組小易于遺傳操作，是異源生物合成的首選底盤。2010年，Ajikumar等[36]使用多元模塊代謝工程，改造大腸桿菌MG1655的衍生株，通過引入合成紫杉二烯所需的GGPPS及TS 2個(gè)催化酶基因，調(diào)節(jié)上游內(nèi)源合成模塊與下游外源模塊間的代謝流平衡，紫杉二烯的搖瓶初始產(chǎn)量即已達(dá)到0.3 g/L。隨后，采用分批補(bǔ)料發(fā)酵，添加正十二烷的雙液相發(fā)酵等優(yōu)化手段，使紫杉二烯的產(chǎn)量提升到1.02 g/L的高水平。進(jìn)一步地，借助后續(xù)引入的T5αH基因（截去跨膜蛋白編碼區(qū)）與P450還原酶基因（缺失N-端跨膜區(qū)）融合蛋白酶的催化作用，最終實(shí)現(xiàn)了5α-羥基紫杉二烯的異源生物合成，檢測(cè)產(chǎn)量達(dá)58 mg/L。2016年，Biggs等[37]通過優(yōu)化CYP及P450還原伴侶蛋白細(xì)胞色素還原酶（CPR）的相互作用機(jī)制，N-端修飾等，使大腸桿菌表達(dá)的氧化紫杉烷類產(chǎn)量達(dá)到（570±45）mg/L。上述工作利用模塊化思路，優(yōu)化重構(gòu)途徑的耦合，通過改造CYP基因，突破了其在大腸桿菌底盤活性表達(dá)的難題，然而從GGPP到紫杉醇的19步催化，其中8～9步是由CYP負(fù)責(zé)的羥基化反應(yīng)，由于原核系統(tǒng)缺乏完整的內(nèi)膜系統(tǒng)，難以定位高活性表達(dá)P450酶[38]。此外，在植入較多的異源基因時(shí)，原核底盤將出現(xiàn)能量代謝障礙等，因此，利用釀酒酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)，可能更適用于構(gòu)建含多步羥基化的合成通路。

釀酒酵母系統(tǒng)可提供更充足的還原型輔酶II（NADPH），其所具有的完整內(nèi)膜系統(tǒng)可定位表達(dá)參與紫杉醇合成的眾多II型CYP及CPR等[39-41]。通過共轉(zhuǎn)化參與紫杉醇合成的GGPPS、TS、T5αH、T10βH及紫杉烯醇5α-乙酰氧化基轉(zhuǎn)移酶（taxadienol 5α-O-acetyl transferase，TAT），Dejong等[42]嘗試打通從IPP直接合成taxdiene-5α-acetate- 10β-ol的代謝通路，然而遺憾的是，檢測(cè)結(jié)果顯示紫杉二烯的產(chǎn)量只有1.0 mg/L，T5αH的催化產(chǎn)物taxadiene-5α-ol積累量?jī)H為25 μg/L，未檢測(cè)到T10βH以及TAT對(duì)應(yīng)的催化產(chǎn)物。由于從MVA途徑出發(fā)，不僅可產(chǎn)生萜類產(chǎn)物，還可為甾體類物質(zhì)的合成提供原料，二者存在碳流量競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。Engels等[43]通過引入3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）的同工酶UPC2.1基因，促使酵母從外環(huán)境中吸收甾體，抑制胞內(nèi)甾體物質(zhì)的合成。此外，采用嗜酸熱硫化葉菌來源的GGPPS替代紅豆杉來源的GGPPS，賦予酵母利用IPP或DMAPP底物合成GGPP的能力，避免與角鯊烯合成競(jìng)爭(zhēng)FPP，輔助以密碼子優(yōu)化手段，最終使酵母系統(tǒng)的GGPP表達(dá)量達(dá)到33.1 mg/L，紫杉二烯的產(chǎn)量達(dá)到8.7 mg/L。盡管利用釀酒酵母更利于CYP和CPR的活性表達(dá)，但由于MVA途徑的代謝流量相對(duì)MEP途徑較低，前者可為下游合成提供的基礎(chǔ)原料量遠(yuǎn)低于后者，這很可能是引起利用大腸桿菌或釀酒酵母表達(dá)紫杉二烯產(chǎn)量相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)的關(guān)鍵因素。鑒于此，2015年，Zhou等[44]嘗試通過大腸桿菌大量合成紫杉二烯，供應(yīng)已植入T5αH、T10βH及對(duì)應(yīng)CPR的釀酒酵母底盤，成功實(shí)現(xiàn)了工程化共培養(yǎng)合成taxadien-5α-acetate-10β-ol（1 mg/L）。此項(xiàng)工作巧妙結(jié)合了2種經(jīng)典底盤的優(yōu)勢(shì)，通過合理設(shè)計(jì)極大拓寬了利用微生物底盤生產(chǎn)紫杉醇類活性產(chǎn)物的空間[45]。

3.2.2  利用植物底盤合成紫杉醇前體  利用植物細(xì)胞異源合成復(fù)雜的天然產(chǎn)物，相對(duì)微生物底盤具有多種優(yōu)勢(shì)。自養(yǎng)型的植物細(xì)胞，直接同化CO2作為碳源，借助光合作用產(chǎn)生充足的還原力，同時(shí)可有效改善在微生物中極難實(shí)現(xiàn)的CYP高活性表達(dá)[46-47]。目前，已有多個(gè)研究組嘗試?yán)萌藚⒏鵞48]、煙草[49]等表達(dá)TS異源合成紫杉二烯，但最高報(bào)道產(chǎn)量?jī)H為27 μg/g[49]，似乎并未顯示出植物底盤應(yīng)有的優(yōu)勢(shì)。Li等[19]采用葉綠體區(qū)室化策略，定位表達(dá)TS、T5αH及其對(duì)應(yīng)的CPR，顯著縮短了GGPPS-TS-T5αH/CPR連續(xù)催化反應(yīng)的空間位阻，成功在本氏煙草中合成了5α-羥基紫杉二烯（0.9μg/g）。隨后，通過選擇性阻斷MVA途徑，結(jié)合代謝工程手段，最終使紫杉二烯合成量達(dá)到56 μg/g，5α-羥基紫杉二烯產(chǎn)量達(dá)到1.3 μg/g，該項(xiàng)工作是近些年利用植物底盤合成紫杉醇前體所取得的重要突破。然而不難看出，盡管利用植物底盤合成同樣源于植物的天然產(chǎn)物具有理論上的優(yōu)勢(shì)，但相比微生物底盤，其在遺傳操作難度、培養(yǎng)條件、規(guī)?；囵B(yǎng)等方面所具有的先進(jìn)性并不顯著，因此，實(shí)現(xiàn)紫杉醇或其關(guān)鍵前體的異源植物細(xì)胞合成，仍有待漫長(zhǎng)的探索路程。

4  結(jié)語與展望

植物源次生代謝產(chǎn)物種類繁多、功能多樣，常對(duì)人體具有較強(qiáng)的生理活性，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥臨床。在抗腫瘤藥物市場(chǎng)，銷售較好的植物天然活性產(chǎn)物及相關(guān)衍生物主要有紫杉醇、多烯紫杉醇、羥基喜樹堿[50]及長(zhǎng)春瑞賓[51]等。通過從植物中分離提取藥物前體或原料，配合特定的化學(xué)修飾及生物轉(zhuǎn)化，仍是目前獲得高活性藥物的主要途徑。如年銷售額超1 000億美元的甾體激素藥物，是僅次于抗生素的第二大類藥物，其合成基礎(chǔ)便是利用植物源的甾醇類物質(zhì)為出發(fā)原料，經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）、雄甾-4-烯-3,17-二酮（ADD）及9α-羥基化-AD（9-OHAD）等中間體，再經(jīng)后續(xù)的化學(xué)和生物轉(zhuǎn)化，幾乎可獲得所有種類的臨床用甾體藥物[52-53]。

紫杉醇類藥物市場(chǎng)需求龐大，鑒于半化學(xué)合成、植物提取及細(xì)胞培養(yǎng)等主流方法存在的問題，有必要針對(duì)性地開展研究逐個(gè)突破，嘗試徹底解決紫杉醇類原料藥的供需失衡問題（表1）。

半化學(xué)合成依賴于從紅豆杉中提取巴卡亭III前體，后續(xù)化學(xué)修飾步驟太長(zhǎng)，產(chǎn)率過低。從紅豆杉直接提取紫杉醇所引起的生態(tài)及環(huán)保問題嚴(yán)重。細(xì)胞培養(yǎng)法操作復(fù)雜，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求極高，通常還需外源添加誘導(dǎo)物才能獲得較高產(chǎn)量。相對(duì)于培養(yǎng)樹皮細(xì)胞，利用內(nèi)生真菌獲取紫杉醇具有菌體生長(zhǎng)迅速、培養(yǎng)難度較小等優(yōu)點(diǎn)，是一條頗具研究?jī)r(jià)值的途徑。然而，內(nèi)生真菌合成紫杉醇的產(chǎn)量不穩(wěn)定，常會(huì)隨著傳代數(shù)次的增加，逐漸喪失紫杉醇的合成能力[54]。通過從內(nèi)生真菌中擴(kuò)增催化合成紫杉醇的途徑基因，發(fā)現(xiàn)其序列與宿主紅豆杉來源的同源基因具有極高的相似性，推測(cè)內(nèi)生真菌合成紫杉醇的能力可能是源于宿主的基因轉(zhuǎn)移，而非共進(jìn)化的結(jié)果[55]，此觀點(diǎn)使得利用內(nèi)生真菌培養(yǎng)獲得紫杉醇的研發(fā)之路撲朔迷離。

基于合成生物學(xué)理念，加州大學(xué)伯克利分校的Keasling院士團(tuán)隊(duì)[40]建立了利用釀酒酵母直接合成青蒿酸，再經(jīng)修飾合成青蒿素的半化學(xué)生產(chǎn)路線。2013年，在先前引入的P450酶（CYP71V1）及CPR1基礎(chǔ)之上，通過協(xié)同表達(dá)新鑒定的青蒿酸醛脫氫酶、醇脫氫酶及細(xì)胞色素b5等，借助這幾個(gè)酶的協(xié)同催化，從紫穗槐二烯合成青蒿酸的3步氧化反應(yīng)效率得到大幅增強(qiáng)，青蒿酸產(chǎn)量達(dá)到25 g/L。同年，Sanofi-Aventis公司與Keasling團(tuán)隊(duì)合作，正式啟動(dòng)60萬噸產(chǎn)能的青蒿素項(xiàng)目。此工作對(duì)于天然活性產(chǎn)物的合成生物學(xué)研究具有極其重要的借鑒與參考價(jià)值。對(duì)于紫杉醇的生物合成，如利用植物底盤異源合成，同樣需實(shí)現(xiàn)數(shù)個(gè)CYP的活性表達(dá)，由此，通過集中研究突破紅豆杉樹皮細(xì)胞培養(yǎng)存在的瓶頸問題，不失為一條更直接的方案。而利用真核微生物底盤具有生產(chǎn)周期短、代謝清晰、產(chǎn)物單一、易于分離、供應(yīng)穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、手性中心多、化學(xué)合成成本高昂的天然產(chǎn)物及前體，具有較好的研發(fā)及應(yīng)用前景。近些年，亞細(xì)胞區(qū)室化定位[56]，蛋白支架或融合表達(dá)關(guān)鍵酶基因[57]等代謝強(qiáng)化策略的出現(xiàn)，顯著降低了連續(xù)催化反應(yīng)的傳質(zhì)位阻，使異源合成目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率得到大幅提升。2018年，Shao等[58]通過15輪的染色體融合，成功將釀酒酵母的16條染色體融合，創(chuàng)建了只有1條巨大染色體的釀酒酵母菌株。如能在此基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步的基因刪減構(gòu)建具有極簡(jiǎn)基因組的釀酒酵母底盤，則很可能為合成高值產(chǎn)物提供一款高效的表達(dá)系統(tǒng)。然而需注意的是，由于紫杉二烯下游涉及CYP催化的多步羥基化反應(yīng)，其中尚有4個(gè)CYP酶未鑒定，因此在異源合成紫杉醇或其關(guān)鍵前體的研究中，除需解決CYP異源活性表達(dá)的難題之外，還需預(yù)先實(shí)現(xiàn)對(duì)紫杉醇合成通路的全面解析。由此，利用異源底盤合成天然產(chǎn)物的研究，尚存在眾多關(guān)鍵難題亟待解決[19,59]。