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摘要  目的：建立肌苷注射劑雜質(zhì)分析方法，評(píng)價(jià)處方工藝合理性。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent TC C18-2(4.6mm×250mm， 5μm)，以甲醇-水(5∶95)為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm(5-羥甲基糠醛檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm)，進(jìn)樣量10 μL；通過破壞實(shí)驗(yàn)、原料及四種肌苷注射劑共計(jì)18批次樣品雜質(zhì)的測(cè)定，分析肌苷原料和注射劑雜質(zhì)的來源。結(jié)果：肌苷原料的工藝雜質(zhì)為鳥苷、次黃嘌呤和腺苷，注射劑中主要降解雜質(zhì)為次黃嘌呤，5-羥甲基糠醛為肌苷葡萄糖注射液中葡萄糖的降解產(chǎn)物；肌苷及各已知雜質(zhì)之間分離度良好。結(jié)論：現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)增加已知雜質(zhì)及其他單個(gè)雜質(zhì)的控制，由于處方及工藝合理性存在問題，肌苷注射液與肌苷葡萄糖注射液兩種劑型安全性存在一定風(fēng)險(xiǎn)。

 

關(guān)鍵詞：肌苷注射液；注射用肌苷；肌苷氯化鈉注射液；肌苷葡萄糖注射液；雜質(zhì)；劑型合理性

 

Impurity analysis of inosine injection and discussion on rationality of their formulations and processes

 

KAN Weina， WANG Ji，YANG Hongwei

 

(Liaoning Institute for Drug Control， Shenyang 110036，China)

 

Abstract  Objective： To establish an impurity analysis method for inosine injections and evaluate the rationality of formulations and processes. Methods： HPLC separation was carried out in an Agilent TC C18-2 column (4.6 mm×250 mm，5μm) under the isocratic elution of methanol-water (5∶95). The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was 30 ℃. The detection wavelength was 248nm(280nm for 5-hydroxymethyl furfural) and the injection volume was 10 μL. The sources of impurities of drug substance of Inosine and Inosine Injections were analyzed by the degradation test and the impurities determination of 18 batches of drug substance of inosine and four kinds of Inosine Injections. Results： Guanosine，hypoxanthine and adenosine were identified as the process impurities of Inosine. Hypoxanthine was the main degradation impurity in Inosine Injections，5-hydroxymethyl furfural was the degradation product of glucosein Inosine Glucose Injection. The resolutions between inosine and the known impurities peaks were good. Conclusion： The known impurities and other individual impurity should be controlled in the specifications. Due to the problems of rationality of formulations and processes，Inosine Injection and Inosine Glucose Injection have certain safety risks.

 

Keywords：inosine injection; inosine for injection; inosine sodium chloride injection; inosine glucose injection; impurity; rationality of dosage form

 

肌苷為細(xì)胞代謝改善類藥物[1]，用于治療心臟病、肝病、白血球減少癥、血小板減小癥、視神經(jīng)萎縮、中心視網(wǎng)膜炎，能預(yù)防及解除由血防藥物引起的對(duì)心臟或肝臟的副作用[2]。

 

肌苷制劑分為口服制劑和注射劑[1]，其中《中華人民共和國(guó)藥典》(簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)收載的注射劑包括肌苷注射液、注射用肌苷、肌苷氯化鈉注射液和肌苷葡萄糖注射液不易口服給藥的患，注射劑具有藥效迅速，作用可靠等優(yōu)勢(shì)，尤其適用于不易口服給藥的患者。但由于注射劑特殊的使用途徑，導(dǎo)致其毒副作用顯著，因此對(duì)于處方工藝、生產(chǎn)包裝以及產(chǎn)品質(zhì)量都有更高的要求。

 

本文參考文獻(xiàn)[1]，調(diào)整流動(dòng)相組成，使肌苷及已知雜質(zhì)與相鄰峰得到良好分離，建立肌苷注射劑雜質(zhì)的分析方法，并通過對(duì)四種注射劑雜質(zhì)的分析，結(jié)合產(chǎn)品的處方及生產(chǎn)工藝，探討四種注射劑劑型及處方工藝的合理性。

 

1 儀器與試藥

 

1.1 儀器

 

島津LC-20A高效液相色譜儀，Aglient 1200高效液相色譜儀；pH計(jì)，電子天平(MettlerToledo)。

 

1.2 試劑試藥

 

鳥苷對(duì)照品(批號(hào)：111977-201501)，次黃嘌呤對(duì)照品(批號(hào)140661-200903)，腺苷(批號(hào)110879-201703)，5-羥甲基糠醛(批號(hào)111626-201912)均來自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

 

1.3 樣品信息

 

肌苷原料(A廠家：批號(hào)17115134)；肌苷注射液(規(guī)格2mL：0.1 g)(B廠家：批號(hào)180101273；C廠家：批號(hào)171003；D廠家：批號(hào)1801030；E廠家：批號(hào)1612061A；F廠家：批號(hào)18040129；G廠家：批號(hào)180516001B)；注用肌苷(H廠家：規(guī)格0.2g，批號(hào)17120105；規(guī)格0.5 g，批號(hào)18030405；規(guī)格0.6 g，批號(hào)17060204；I廠家：規(guī)格0.2g，批號(hào)11804022；規(guī)格0.4 g，批號(hào)1180301；規(guī)格0.6 g，批號(hào)1180101)；肌苷氯化鈉注射液(J廠家：規(guī)格100mL：肌苷0.6 g與氯化鈉0.9g，批號(hào)180528041；K廠家：規(guī)格250mL：肌苷0.5 g與氯化鈉2.25 g，批號(hào)K18012701；L廠家：規(guī)格100mL：肌苷0.5 g與氯化鈉0.9 g，批號(hào)1805132331；M廠家：規(guī)格100mL：肌苷0.6 g與氯化鈉0.9 g，批號(hào)3A18041005)；肌苷葡萄糖注射液(N廠家：規(guī)格100mL：肌苷0.6 g與葡萄糖5.0 g，批號(hào)20180402，20180601)。

 

2 方法與結(jié)果

 

2.1 色譜條件

 

色譜柱為Agilent TC C18-2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(5∶95)；流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm(5-羥甲基糠醛檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm)。進(jìn)樣量為10 μL。

 

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

 

取次黃嘌呤、鳥苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加水制成每1 mL約含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取肌苷對(duì)照品適量，精密加入一定量的次黃嘌呤和鳥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，加水溶解并稀釋制成含肌苷0.5 mg·mL-1、次黃嘌呤1 μg·mL-1和鳥苷2.5 μg·mL-1的溶液。依法測(cè)定，色譜圖見圖1。肌苷峰與鳥苷峰的分離度應(yīng)大于3.0，肌苷峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于1.5，理論板數(shù)按肌苷峰計(jì)不低于2 000。

 

1.次黃嘌呤(hypoxanthine)  2. 肌苷(inosine)  3. 鳥苷(guanosine)

圖1  肌苷有關(guān)物質(zhì)測(cè)定系統(tǒng)適用性色譜圖

Fig.1  HPLC chromatogram of system suitability for related substances of inosine

 

2.3 溶液的配制

 

2.3.1 對(duì)照品溶液

 

取次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 mL約含次黃嘌呤1μg·mL-1、鳥苷2.5μg·mL-1、腺苷1 μg·mL-1和5-羥甲基糠醛1μg·mL-1的溶液，作為混合對(duì)照品溶液，依法測(cè)定。

 

2.3.2 供試品溶液

 

精密量取樣品適量，加水稀釋制成含肌苷0.5 μg·mL-1的溶液，依法測(cè)定。

 

2.4 專屬性試驗(yàn)

 

2.4.1 輔料干擾  試驗(yàn)合肌苷氯化鈉注射液、肌苷注射液、注射用肌苷和肌苷葡萄糖注射液供樣企業(yè)提供的處方，按最大使用量配制，制成混合輔料溶液。典型色譜圖見圖2。結(jié)果顯示輔料對(duì)肌苷及次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛的測(cè)定不存在干擾。

 

圖2  混合輔料溶液高效液相色譜圖

Fig.2  HPLC chromatogram of mixed excipients solution

 

2.4.2 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

 

熱破壞：稱取肌苷原料適量，置190 ℃，加熱30 min，加水溶解稀釋制成肌苷濃度約為2 mg·mL-1的溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖。

 

強(qiáng)酸破壞：稱取肌苷原料適量，加0.1 mol·L-1鹽酸2 mL，100℃水浴30 min，放冷，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉2 mL，加水稀釋制成肌苷濃度約為2 mg·mL-1的溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖。

 

強(qiáng)堿破壞：稱取肌苷原料適量，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉2 mL，100℃水浴30 min，放冷，加0.1 mol·L-1鹽酸2 mL，加水稀釋制成肌苷濃度約為2 mg·mL-1的溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖。

 

氧化破壞：稱取肌苷原料適量，加3%過氧化氫5mL，室溫放置30 min，加水稀釋制成肌苷濃度約為2 mg·mL-1的溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖。

 

光照破壞：稱取肌苷原料適量，置照度4600Lx光源下，光照24 h，加水溶解稀釋制成肌苷濃度約為2 mg·mL-1的溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖。

 

結(jié)果顯示(如圖3)，在上述條件下破壞產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均能與主峰分離，專屬性良好。熱破壞降解產(chǎn)物較多，主要為次黃嘌呤，還有其他未知雜質(zhì)；強(qiáng)酸破壞主要降解產(chǎn)物為次黃嘌呤；強(qiáng)堿破壞產(chǎn)生多種未知雜質(zhì)峰，但響應(yīng)值較低；氧化及光照破壞無明顯降解產(chǎn)物產(chǎn)生。

 

2.5 線性關(guān)系試驗(yàn)

 

取肌苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，精密稱定，分別加水制成每1mL約含0.2mg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取一定量，加水稀釋制成含肌苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺苷、5-羥甲基糠醛系列濃度的混合對(duì)照溶液，作為線性溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。

 

2.6 定量限和檢出限

 

取次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密量取一定量，加水稀釋制成含次黃嘌呤、鳥苷、腺苷5-羥甲基糠醛的混合對(duì)照溶液，并加水逐級(jí)稀釋，并依法測(cè)定。以S/N＞10計(jì)，次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛的定量限分別為0.015 6 μg·mL-1、0.054 1 μg·mL-1、0.069 6 μg·mL-1和0.064 1 μg·mL-1。以S/N＞3計(jì)，次黃嘌呤、鳥苷、腺苷和5-羥甲基糠醛的最低檢出限分別為0.003 9 μg·mL-1、0.013 5 μg·mL-1、0.017 4 μg·mL-1和0.016 0 μg·mL-1。

 

2.7 有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

 

按“2.3”項(xiàng)方法制備溶液，依法測(cè)定，其中肌苷葡萄糖注射液同時(shí)在248 nm與280 nm的雙波長(zhǎng)下測(cè)定。4種肌苷注射劑有關(guān)物質(zhì)典型色譜圖見圖3。次黃嘌呤等4種已知雜質(zhì)采用外標(biāo)法，以相當(dāng)于肌苷標(biāo)示量的百分含量計(jì)，最大未知雜質(zhì)含量及其他雜質(zhì)之和采用面積歸一化法計(jì)。13個(gè)生產(chǎn)企業(yè)18批次4種肌苷注射劑有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果見表2。

 

 

A.堿破壞(alkalihy drolysis)  B.酸破壞(acid hydrolysis)  C.光破壞(photolysis)  D.熱破壞(heathy drolysis)  E.氧化破壞(oxidation)  F.原液(stock solution)  1.次黃嘌呤(hypoxanthine)  2.肌苷(inosine)  3.鳥苷(guanosine)  4.腺苷(adenosine)  5～8.未知雜質(zhì)(unknown impurities)

圖3  肌苷原料強(qiáng)制降解試驗(yàn)色譜圖

Fig.3  HPLC chromatograms of forced degradation solution of inosine

 

 

3 討論

 

肌苷是經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵得到的核苷類化合物。鳥苷與腺苷同為肌苷工藝雜質(zhì)，亦是枯草桿菌發(fā)酵的產(chǎn)物，由于結(jié)構(gòu)與肌苷較為相似，純化過程難以完全去除；次黃嘌呤是工藝雜質(zhì)也是降解雜質(zhì)，它既是枯草桿菌發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物，也是肌苷主要的水解產(chǎn)物；5-羥甲基糠醛是含糖物質(zhì)在加熱過程中產(chǎn)生的，對(duì)眼睛、上呼吸道、皮膚和黏膜等有刺激性，對(duì)人體橫紋肌及內(nèi)臟有損害，具有神經(jīng)毒性，能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生蓄積中毒[3-4]，是肌苷葡萄糖注射液需要控制的雜質(zhì)之一。

 

4種肌苷注射劑中，肌苷注射液未知雜質(zhì)的雜質(zhì)數(shù)量最多及含量最高，肌苷葡萄糖注射液中，已知雜質(zhì)次黃嘌呤含量最高，肌苷氯化鈉注射液中已知雜質(zhì)鳥苷的含量最高，注射用肌苷中已知雜質(zhì)和總雜的含量最低，雜質(zhì)數(shù)量最少。

 

鳥苷和腺苷為工藝雜質(zhì)，其含量間接反映肌苷原料的質(zhì)量，與制劑處方及工藝過程關(guān)聯(lián)較小。肌苷注射液中檢出的雜質(zhì)除次黃嘌呤、鳥苷及腺苷外，其他未知雜質(zhì)多達(dá)7個(gè)，其他雜質(zhì)總量最高達(dá)1.0%，考慮是由于肌苷注射液本身肌苷含量較高(50 mg·mL-1)，標(biāo)準(zhǔn)提高調(diào)研資料顯示，其制備工藝為肌苷加熱溶解于氫氧化鈉溶液中，由于肌苷溶液在加熱及強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解，未知雜質(zhì)多為堿加熱降解的產(chǎn)物，這些未知雜質(zhì)是否具有毒性還需要進(jìn)一步的確認(rèn)。5-羥甲基糠醛是葡萄糖單糖化合物在高溫或弱酸環(huán)境等條件下脫水產(chǎn)生的一種醛類化合物，當(dāng)pH值偏低或受熱溫度過高，葡萄糖易轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥甲基糠醛，若pH偏高，葡萄糖引起差向異構(gòu)化，生成果糖，受熱生成5-羥甲基糠醛的速度更快，所以，葡萄糖為載體的注射劑pH值均控制在弱酸性[5]?！吨袊?guó)藥典》2015年版肌苷葡萄糖注射液要求控制pH值在4.0～6.0，而肌苷作為堿性藥物，溶液在偏堿性條件下相對(duì)穩(wěn)定，因此，肌苷葡萄糖注射液中雜質(zhì)次黃嘌呤的含量遠(yuǎn)高于其他幾種注射劑。

 

從表2結(jié)果可以看出，肌苷氯化鈉注射液，由于處方中肌苷含量較低，產(chǎn)品pH值控制在6.0～8.0，肌苷在該條件下相對(duì)穩(wěn)定，雜質(zhì)較少；注射用肌苷為以甘露醇為骨架的凍干塊狀物，降解雜質(zhì)少，質(zhì)量更加穩(wěn)定。

 

綜上，肌苷注射液由于工藝的因素，雜質(zhì)數(shù)量與含量顯著高于其他幾種注射劑型，肌苷葡萄糖注射液由于處方的因素，導(dǎo)致雜質(zhì)次黃嘌呤的含量顯著高于其他幾種注射劑型。肌苷注射液和肌苷葡萄糖注射液安全性存在較大風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中[1]，只對(duì)肌苷注射劑中的總雜質(zhì)的限度進(jìn)行了規(guī)定，不足以控制各肌苷注射劑品種的質(zhì)量，從注射劑的特殊性考慮，有必要對(duì)已知雜質(zhì)及其他未知雜質(zhì)從嚴(yán)控制。生產(chǎn)企業(yè)也應(yīng)該從產(chǎn)品的原料、處方和工藝過程中，分析雜質(zhì)的來源，優(yōu)選原輔料，合理設(shè)計(jì)處方及工藝從而更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

 

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闞微娜，王棘，楊宏偉

(遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，沈陽 110036)