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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2021-11-05 20:51
復(fù)方穿心蓮片HPLC指紋圖譜研究
黃煒忠1，毛鑫1，黃俊忠2，喬莉2，滕云霞1，張飛宇1，李華2
（1. 廣東羅浮山國(guó)藥股份有限公司，廣東惠州 516133；
2. 廣東省藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，
廣東省生物醫(yī)藥科技協(xié)同創(chuàng)新中心，廣州 510663）
摘要 目的：建立復(fù)方穿心蓮片指紋圖譜研究方法，為復(fù)方穿心蓮片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提出修訂建議。方法：采用Thermo scientific Syncronis aQ C18（4.6 mm×250mm，5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫；以270nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，建立復(fù)方穿心蓮片指紋圖譜，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”對(duì)市售65批次復(fù)方穿心蓮片進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：建立的復(fù)方穿心蓮片指紋圖譜共確定6個(gè)共有峰，65個(gè)批次相似度在0.449～0.994之間且差異較大，平均值為0.927，考慮到藥材的來(lái)源及大生產(chǎn)帶來(lái)的影響，認(rèn)為供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度應(yīng)不得低于0.90較為合理。結(jié)論：本方法穩(wěn)定可控，可用于復(fù)方穿心蓮片的質(zhì)量控制。
關(guān)鍵詞：復(fù)方穿心蓮片；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；指紋圖譜
Fingerprint analysis of compound Andrographis paniculate
tablets by HPLC*
HUANG Weizhong1，MAO Xin1， HUANG Junzhong2， QIAO Li2， TENG Yunxia1，
ZHANG Feiyu1，LI Hua2**
（1. Guangdong Luofushan Sinopharm Co.，Ltd.， Huizhou 516133，China；
2. Guangdong Institute for Drug Control，Key Laboratory of Rapid Drug Testing
Technology of the State Drug Administration，
Guangdong Biomedical Technology Collaborative Innovation Center， Guangzhou 510663，China）
Abstract Objective： To establish a fingerprint analysis of compound Andrographis paniculate tablets （CAT）， and to propose amendments to the quality standard of CAT. Methods： The fingerprint of CAT was established using a Thermo Scientific Syncronis aQ C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with a gradient elution of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution delivered at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 270 nm and column temperature was 30 ℃. The similarity evaluation of 65 batches of CAT was tested using the “Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system （2012 version）”. Results：A total of 6 common peaks were identified in the fingerprint spectrum of CAT. The similarity of 65 batches varied greatly from 0.449 to 0.994 with an average value of 0.927. Considering the source of the herb and the impact of large-scale production，the similarity between the fingerprint of the test product and the comparison fingerprint should be no less than 0.90. Conclusion： This method is stable and control lable，and can be used for the quality control of CAT.
Key words： compound Andrographispaniculate tablets; quality standard; fingerprint analysis
復(fù)方穿心蓮片是由穿心蓮和路邊青兩味中藥組成，其中穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata （Burm. f.）Nees的干燥地上部分，路邊青為馬鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.的干燥地上部分；功能清熱解毒，涼血，利濕。用于風(fēng)熱感冒，喉痹，痄腮，濕熱泄瀉等[1]。該品種現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十九冊(cè)WS3-B-3624-98，當(dāng)前質(zhì)量控制項(xiàng)目?jī)H有性狀、鑒別、檢查三項(xiàng)，難以全面有效的控制本品質(zhì)量。
目前，針對(duì)穿心蓮的研究較為深入，現(xiàn)代研究表明穿心蓮的二萜內(nèi)酯類成分為其主要的活性成分，其中以穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量最高，因此二者被《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）、EP、USP等多個(gè)國(guó)家、地區(qū)藥典作為指標(biāo)成分，控制穿心蓮藥材的質(zhì)量[2-6]。另一方面，由于路邊青藥材未被《中國(guó)藥典》收載，且化學(xué)研究薄弱，缺乏質(zhì)量控制指標(biāo)，目前僅有該品種根部的含量測(cè)定研究報(bào)道[7]?；诋?dāng)前穿心蓮和路邊青的研究現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)擬建立指紋圖譜檢測(cè)方法，以期全面控制復(fù)方穿心蓮片的質(zhì)量。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 儀器
島津高效液相色譜儀（LC-20AD泵，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10ASvp柱溫箱，SPD-M20A檢測(cè)器，CBM-20A控制器）；安捷倫1200高效液相色譜儀；賽默飛U3000高效液相色譜儀；雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Unique-R20超純水儀（廣州譽(yù)為生物科技儀器有限公司）；AB135-S十萬(wàn)分之一天平（Mettler Toledo 公司）；ML204萬(wàn)分之一電子天平（MettlerToledo 公司）。
Thermo scientific SyncronisaQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；Welch Materials Xtimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；Phenomenex Kinetex C18 100A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。
1.2 試劑
穿心蓮對(duì)照藥材（批號(hào)：121082-201706）、路邊青對(duì)照藥材（批號(hào)：121227-201305）、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：110854-201710），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。路邊青藥材，批號(hào)：C125190801，產(chǎn)地：廣東，購(gòu)自遂溪縣海圖藥業(yè)有限公司；穿心蓮藥材，批號(hào)：C032191114，產(chǎn)地：廣東，購(gòu)自雷州市芝蘭農(nóng)業(yè)種植專業(yè)合作社。
甲醇、磷酸均為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水。
1.3 樣品
本研究收集了全國(guó)市場(chǎng)上常見(jiàn)的17個(gè)廠家共65個(gè)批次的復(fù)方穿心蓮片樣品。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～15min，2%→10% A；15～85min，10%→35% A；85～100min，35%→60% A），檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。
2.2 對(duì)照品溶液的制備
取脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.10 mg的溶液，即得。
2.3 供試品溶液的制備
取本品5片，除去包衣，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率550 W，頻率45 kHz）45 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得。
2.4 指紋圖譜的建立
2.4.1 共有峰的確認(rèn)
對(duì)市售17個(gè)廠家共65個(gè)批次復(fù)方穿心蓮片樣品按照供試品溶液制備方法處理，按擬定的指紋圖譜方法進(jìn)樣，記錄色譜圖，根據(jù)色譜峰位置固定且易于辨認(rèn)的原則，選定了6個(gè)色譜峰作為特征峰。進(jìn)一步選擇其中16個(gè)廠家共33批代表性批次，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件生成對(duì)照?qǐng)D譜，如圖1所示。
2.4.2 色譜峰指認(rèn)
取穿心蓮及路邊青對(duì)照藥材及脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，按照供試品及對(duì)照品溶液制備方法處理，按擬定的指紋圖譜方法進(jìn)樣，記錄色譜圖，根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間信息，對(duì)指紋圖譜的共有峰進(jìn)行歸屬。6個(gè)共有峰中：1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)峰歸屬于穿心蓮藥材；2號(hào)、5號(hào)、6號(hào)峰歸屬于路邊青藥材，其中4號(hào)峰為脫水穿心蓮內(nèi)酯，見(jiàn)圖2。
2.5 方法學(xué)考察
2.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一批供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、18、24、36、48 h按擬定的指紋圖譜方法進(jìn)樣，記錄色譜圖。以脫水穿心蓮內(nèi)酯為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果測(cè)得1～6號(hào)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.09%、0.06%、0.06%、0.00%、0.01%及0.01%，共有峰的相對(duì)峰面積RSD分別為0.32%、0.50%、0.34%、0.00%、0.86%以及0.34%；采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件進(jìn)行處理，8次進(jìn)樣的圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度均為1.000，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批樣品，精密稱定6份，制備供試品溶液，按擬定的指紋圖譜方法進(jìn)樣，記錄色譜圖。以脫水穿心蓮內(nèi)酯為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果測(cè)得1～6號(hào)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.04%、0.04%、0.03%、0.00%、0.01%以及0.01%，共有峰的相對(duì)峰面積RSD分別為0.28%、0.17%、0.19%、0.00%、0.72%以及0.20%；采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2010版）”軟件進(jìn)行處理，6份樣品的圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度均為1.000，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。
2.5.3 色譜柱考察
取同一批供試品溶液，使用三種不同色譜柱，按擬定的指紋圖譜方法進(jìn)樣，記錄色譜圖。對(duì)比不同色譜柱測(cè)得的三個(gè)色譜圖發(fā)現(xiàn)，不同色譜柱所對(duì)應(yīng)的6個(gè)共有峰保留時(shí)間有所差異，但是色譜峰的分離度較好，峰面積及相對(duì)位置較為固定。結(jié)果如圖3所示。
2.5.4 制劑與藥材色譜峰對(duì)比
采用穿心蓮藥材、穿心蓮干膏（按復(fù)方穿心蓮片工藝制備）、路邊青藥材、路邊青干膏（按復(fù)方穿心蓮片工藝制備）與復(fù)方穿心蓮片，按照供試品制備方法處理，按擬定的指紋圖譜方法進(jìn)樣，記錄色譜圖，經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，穿心蓮及路邊青藥材在制成干膏前后色譜峰的峰面積及色譜峰的數(shù)量均有所變化，但各藥材相應(yīng)的特征峰的保留時(shí)間相對(duì)固定，結(jié)果如圖4所示。
2.6 相似度評(píng)價(jià)
測(cè)定結(jié)果及限度制定 將65個(gè)批次樣品與對(duì)照指紋圖譜比較，除62～65批次樣品5號(hào)特征峰缺失導(dǎo)致無(wú)法計(jì)算相似度，其余批次與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.449～0.994間，計(jì)算相似度的平均值為0.927，考慮到藥材的來(lái)源及大生產(chǎn)帶來(lái)的影響，認(rèn)為將本品與對(duì)照指紋圖譜的相似度限度應(yīng)大于0.90較為合理。
3 討論
路邊青藥材研究基礎(chǔ)薄弱，文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)其經(jīng)常與薔薇科植物路邊青（Geum aleppicum Jacq.）混淆[8-10]。路邊青的化學(xué)成分主要有萜類、黃酮類、生物堿類等主要成分[11]。馬建中等發(fā)現(xiàn)“山大青苷”，但關(guān)于山大青苷文獻(xiàn)極少，主要集中在利尿即降血壓方面的藥理研究，1994年后無(wú)相關(guān)研究，且未發(fā)現(xiàn)其對(duì)照品[12-15]。李艷等測(cè)定了山大青根（即路邊青的根）中腺苷和丁香樹(shù)脂酚葡萄糖苷的含量[7]，由于檢測(cè)的藥用部位不同，且腺苷與丁香樹(shù)脂酚葡萄糖苷的藥理活性與路邊青功能主治不一致，因此這兩種成分對(duì)路邊青的質(zhì)量控制參考意義不大。
復(fù)方穿心蓮片的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求偏低，市售藥品質(zhì)量參差不齊，難免出現(xiàn)以次充好等現(xiàn)象，難以保證藥品質(zhì)量，不利于市場(chǎng)良性競(jìng)爭(zhēng)，因此有必要對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高，確保藥品質(zhì)量并規(guī)范市場(chǎng)行為。目前已有研究者對(duì)穿心蓮制劑的薄層色譜及含量測(cè)定方法進(jìn)行了探索[16-18]，本研究則進(jìn)一步針對(duì)其指紋圖譜進(jìn)行深入研究。根據(jù)樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度應(yīng)>0.90這一標(biāo)準(zhǔn)，共有7個(gè)廠家共13個(gè)批次的樣品不符合要求。進(jìn)一步對(duì)樣品進(jìn)行研究分析，部分樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜比較，特征峰的峰面積明顯偏??；其中來(lái)自同一廠家的2個(gè)批次值得特別關(guān)注，此兩個(gè)批次的指紋圖譜中4號(hào)脫水穿心蓮內(nèi)酯峰與對(duì)照?qǐng)D譜比較明顯偏高，而其余5個(gè)特征峰則與對(duì)照?qǐng)D譜比較相對(duì)偏低。
本研究建立的指紋圖譜具有一定的局限性，主要表現(xiàn)為特征峰的成分指認(rèn)存在一定不足，研究中使用穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯以及1，4-去氧穿心蓮內(nèi)酯四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)特征峰進(jìn)行了指認(rèn)，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯以及1，4-去氧穿心蓮內(nèi)酯在270nm波長(zhǎng)處均無(wú)明顯吸收，最終僅確定了4號(hào)特征峰為脫水穿心蓮內(nèi)酯，更多特征峰的指認(rèn)還需要進(jìn)一步研究。
本研究建立的復(fù)方穿心蓮片指紋圖譜，方法穩(wěn)定可控，有利于全面控制復(fù)方穿心蓮片的質(zhì)量。建議復(fù)方穿心蓮片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)增加指紋圖譜項(xiàng)，從而保證藥品質(zhì)量，規(guī)范市場(chǎng)行為，促進(jìn)公平競(jìng)爭(zhēng)。
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