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SEC 是液相色譜的一種主要分離模式，誰家實驗室李還沒有一個SEC，為了大家更好地使用SEC，今天小析就和大家一起看一看SEC的原理、實驗條件選擇、應(yīng)用、常見問題及解決辦法，我們一起分享學習。

 

體積排阻色譜法 (SEC) 近年來被廣泛地應(yīng)用在各個行業(yè)，是研究分子量及分子量分布測試、研究聚合物分子結(jié)構(gòu)，揭示聚合物類樣品物理性能的重要表針手段。在聚合物類產(chǎn)品質(zhì)量的控制、合成工藝的改進過程中發(fā)揮著積極作用。

 

體積排阻色譜的定義

 

排阻色譜法(size exclusion chromatography，SEC)是一種根據(jù)試樣分子的尺寸進行分離的色譜技術(shù)。又稱為凝膠色譜法、分子排阻色譜法、尺寸排阻色譜法等，是液相色譜的一種。

 

體積排阻色譜的分類

 

1、凝膠過濾色譜法-GFC

一般用于分離水溶性的大分子，凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。

 

2、凝膠滲透色譜法-GPC

主要用于有機溶劑中可溶的高聚物相對分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機溶劑。

 

 

SEC的基本原理

 

凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時被排阻，小分子通過時被滯留。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小“排隊”，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。

 

 

 

排阻色譜不適用范圍

 

1、分子直徑比最大孔隙直徑大的分子全部被排阻在凝膠顆粒以外，叫做全排除，兩種或兩種以上的這樣的分子不能達到分離效果。

 

2、直徑比最小孔隙直徑小的分子能全部進入凝膠顆粒內(nèi)部，這樣的兩種或兩種以上的分子也不能達到分離效果。

 

兩種排阻色譜類型比較

 

	凝膠滲透色譜（GPC）	凝膠過濾色譜（GFC）
流動相	采用水溶液或緩沖液作為流動相	采用有機溶劑作為流動相
常用分析物質(zhì)	分析高聚物的摩爾質(zhì)量，如：聚乙烯、聚氯乙烯等	多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多糖等
常用凝膠	交聯(lián)聚苯乙烯凝膠	葡萄糖系列
優(yōu)點	操作簡便，進樣量小，重現(xiàn)性好，自動化程度高	條件溫和，產(chǎn)品回收率近100%，易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度，分析速度快，精度高，分離機理簡單，操作參數(shù)少。
缺點	質(zhì)脆易碎，柱子裝填不緊，柱效低。	選擇性低，料液處理量小，洗脫后產(chǎn)品被稀釋

 

固定相與流動相

 

流動相的選擇

1、必須能溶解樣品，與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。

2、溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑限制分子擴散作用。

3、常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

 

固定相（凝膠）

一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體，含有大量液體(一般是水)，柔軟而富于彈性。

 

分類：

1、按機械強度可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。

2、按化學性質(zhì)分為有機凝膠（均勻凝膠、半均勻凝膠、非均勻凝膠）；無機凝膠（非均勻凝膠）。

 

凝膠過濾介質(zhì)

 

常用的是葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖以及親脂性凝膠。

 

1、葡聚糖凝膠

葡聚糖凝膠是常用凝膠，由葡聚糖和交聯(lián)劑甘油通過醚橋相互交聯(lián)而形成的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

 

 

由于分子內(nèi)含有大量羥基而具有極性，在水和其他極性溶劑如乙二醇、二甲亞砜等中溶脹成凝膠顆粒，因醚鍵的不活潑性，故具有較高的穩(wěn)定性。

 

交聯(lián)度大的孔隙小，吸液膨脹也少，可用于小分子物質(zhì)的分離。交聯(lián)度小的孔隙大，吸液膨脹也大，適用于大分子物質(zhì)的分離。

 

2、聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，干燥粉碎或加工成形制成粒狀。適合蛋白和多糖的純化。

 

 

3、瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學滅菌法處理。它的優(yōu)點是分子量的適用范圍寬。

 

4、親脂性凝膠

親脂性凝膠用于一些難溶于水或有一定程度親脂性的樣品。

（1）聚苯乙烯凝膠：應(yīng)用范圍廣，由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成。機械性能好，孔隙分布比較寬，多應(yīng)用于合成高分子材料的分離和分析。

 

（2）葡聚糖凝膠LH-20：是葡聚糖凝膠G-25分子中引入羥丙基以代替羥基的氫，成醚鍵結(jié)合狀態(tài)，因而具備了一定的親脂性，適用于分離黃酮、色素等有機物。

 

（3）無機凝膠：無機凝膠分為多孔性硅膠和多孔性玻璃，機械性能好，選擇性高。但其吸附性較大，處理極性大的樣品需注意。

 

凝膠特性參數(shù)

（1）排阻極限（exclusion limit):

 指不能擴散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對分子質(zhì)量。

 

（2）分級范圍（fractionation range):

即能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量范圍。

 

（3）溶脹率：

某些市售的干燥凝膠顆粒（如Sephadex G系列），使用前要用水溶液進行溶脹處理，溶脹后每克干凝膠所吸收的水分的百分率稱為溶脹率，即

 

 

（4）凝膠粒徑：

一般為球形，其粒徑大小對分離度有重要影響。粒徑越小，分離效率越高。軟凝膠粒徑較大，一般為50～150um，硬凝膠粒徑較小，一般為5～50um。

 

（5）床體積（bed volume）

即1g干燥凝膠溶脹后所占的體積。

 

（6）孔隙體積（void volume)

指層析柱中凝膠之間孔隙的體積，即V0值?？紫扼w積可用相對分子質(zhì)量大于排阻極限的溶質(zhì)測定。

 

凝膠的選擇

良好的凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足如下要求：

（1）親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學或物理相互作用；

（2）穩(wěn)定性強，在較寬的pH和離子強度范圍以及化學試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長；

（3）具有一定的孔徑分布范圍；

（4）機械強度高，允許較高的操作壓力。

 

影響分離特性的因素

 

1、填料

分離度和蛋白質(zhì)的分離范圍以及最小分子量之比是選擇填料要考慮的首要問題。

 

2、柱長

排阻色譜的分離度與柱長的平方根成正比，一般柱長60-120cm對于蛋白質(zhì)的分離比較理想，而30cm的柱子多用于快速分離。

 

 

3、流速

流速是影響分離的重要因素。一般流速低，分離效果好。如流速在小于0.1ml/min時，蛋白質(zhì)的分離度好；在 0.5-1.0ml/min時，對于7.5mm直徑的柱子，分離效率較高。

 

4、樣品容量

進樣體積和樣品濃度將明顯影響到分離度。高濃度、小體積對分離有利。合適的蛋白質(zhì)樣品濃度范圍一般在0.01-0.5%，樣品體積是柱體積的1-3%。