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     檢測限和定量限是分析方法的重要屬性，在中國藥典2020年版分析方法驗證指導原則中規(guī)定這2項是重要的驗證指標，包括定量、限度的雜質測定需要著重考慮檢測限和定量限，且在該版本指導原則中刪除了校正因子以及其中定量限的規(guī)定。本文試圖從定義、測量方法、常見問題和解決方案進行簡單的討論，為分析方法驗證活動中檢測限和定量限的的開展提供一定的參考。

 

1、檢測限和定量限的定義

 

     檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量，定量限系指試樣中被測物能被定量測定的最低量。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據，沒有定量意義。而對微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質和降解產物時，應確定方法的定量限，需要注意的是定量限的測定結果應符合準確度和精密度要求。

 

2、一般規(guī)定及要求

 

      檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。藥品的鑒別試驗和雜質檢査方法，均應通過測試確定方法的檢測限。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據，沒有定量意義。常用的方法如下。

 

直觀法

 

      用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。

 

信噪比法

 

      用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把巳知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地檢測出的被測物質最低濃度或量。一般以信噪比為3 :1或2 : 1 時相應濃度或注人儀器的量確定檢測限。

 

基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法

 

       按照L O D = 3 .3 δ /S公式計算。式中L O D :檢測限；

 

δ：響應值的偏差；S : 標準曲線的斜率。

 

δ可以通過下列方法測得：①測定空白值的標準偏差；

 

②標準曲線的剩余標準偏差或截距的標準偏差來代替。

 

數(shù)據要求

 

      上述計算方法獲得的檢測限數(shù)據須用含量相近的樣品進行驗證。應附測定圖譜，說明試驗過程和檢測限結果。

 

3、信噪比法具體怎么操作

 

      信噪比的規(guī)定1：一種使空白樣與供試品，以空白樣目標峰位置的信號為噪音（ASTM，此噪音為歐盟和美國認可的噪音參數(shù)）（注意agilent此時應該選擇的噪聲時間至少大于1min，waters建議為半峰寬的20倍），以供試品目標峰的峰高為信號。以此手工計算信噪比。這種方法是最符合藥典要求，限制條件更高，更科學。

 

      信噪比的規(guī)定2：另一種是只用供試品，以供試品除目標峰之外選取基線平滑段為噪音，此法可直接讀出信噪比（性能報告+噪音），但該法對選擇的平滑段存在很大的隨意性，如位置和時間長短（國內有些公司規(guī)定為0.2min）。此法雖然方便快速，而且基本能成功，但其實很大程度上存在數(shù)據拼湊的嫌疑。

 

      另關于噪音的選擇時間USP為>=5倍半峰寬，EP、JP為>=20倍半峰寬。

 

     檢測限：針對數(shù)據的要求問題，除了上述藥典要求外。檢測限應該對比的是同一個樣品6針的平均信噪比（不得小于3）和保留時間（應不大于2.0%）（即藥典雖然沒有要求定量要求（準確度和精密度）），但應保證精密度）

 

     定量限：雜質峰與噪音峰信號的強度比應不得小于10。另外，配制6份最低定量限濃度的溶液，所測6份溶液雜質峰保留時間的相對標準差應不大于2.0%，峰面積的相對標準差應不大于5.0%。3倍信噪比是檢出限，10倍信噪比是定量限，除此之外，檢出限表示方法能測出該物質時的最低濃度。定量限則表示方法能準確定量出該物質的最低濃度。

 

     具體來講：

 

檢測限：分析方法在規(guī)定實驗條件下所能檢出被測組分的最低濃度或最低量；

定量限：分析方法可定量測定樣品中待測組分的最低濃度或最低量。

 

檢出限和定量限的區(qū)別在于：

 

檢測限：

     檢測限指試樣在確定的實驗條件下，被測物能被檢測出的最低濃度或含量。它是限度檢驗效能指標，無需定量測定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可。

 

非儀器分析目視法：

    用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。

 

信噪比法：

     用于能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），將已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，算出能被可靠檢測出的zui低濃度或量。一般以信噪比3∶1或2∶1時的相應濃度或注入儀器的量確定檢測限也可采用標準差法：空白值＝0時；

 

①定背景10次以上，求出標準差σ。

②將σ乘以三倍；

③在工作曲線上求出3σ相對應的濃度X，即為方法的檢出值；空白值不等于0；

 

定量限：

     指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結果應具有一定準確度和精密度要求。

    常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時相應的濃度或注入儀器的量進行確定，也可用儀器所測空白背景響應標準差（SD）的10倍為估計值，再經試驗確定方法的實際測定下限。

 

4、檢測限和定量限的解決方案

 

      因為檢測限和定量限常用測量方法的局限性，因此我們并不需要限定信噪比=3或10，而只需要驗證方法的靈敏度符合要求。如通常檢測限應低于限度的1/30，定量限應低于限度的1/10，但當達不到該要求時，只要規(guī)定定量限比ICH規(guī)定的雜質報告限低即可（如50%報告限）。

 

在檢測限的驗證中，可以通過加標的方法進行信噪比的確認，并可參考USP對于可檢測性的定義和確認步驟：

 

-1：配置一個在限度濃度的雜質標準品溶液；

 

-2：配置一個添加了限度濃度的雜質標準品的樣品標準品溶液；

 

-3：配置一個添加了（限度濃度100%-由Horwitz方程估算%RSD）的雜質標準品的樣品標準品溶液；

 

如果1≤2且3＜2，則差異可以被檢出；否則該方法不能勝任限度檢測。

 

定量限可考慮設置一個低于限度數(shù)倍的低濃度樣品（如5倍），在響應最差的儀器中信噪比仍然遠大于10（如100），其回收率驗證與精密度驗證均符合規(guī)定，則可以認為該數(shù)字可以適用于今后的日常檢測，如果檢測結果小于該值，則直接報告“小于該值”即可[3]。如在采用熒光染色法測定外源性DNA殘留量中，ChP規(guī)定DNA殘留量在1.25～80ng/ml范圍內，本法線性較好，因此供試品DNA殘留量在該范圍內可定量測定；當DNA殘留量低于1.25ng/ml時應為限量測定，表示為小于1.25ng/ml。

 

      設計合理的定量下限對于方法的靈敏度有著很好的保證，在實際操作中只需要驗證定量下限的準確度和精密度符合要求即可。如在復雜基質樣品中，通常以標曲下限作為定量下限，且定量下限的準確度和精密度要求可適當放寬，要求校正標樣回算的濃度一般應該在標示值的±15%以內，定量下限處應該在±20%內，質控樣品準確度均值一般應在質控樣品標示值的±15%之內，定量下限準確度應在標示值的±20%范圍內。

 

     信噪比作為容易獲得的參數(shù)，在檢測限和定量限的測定中使用非常方便。主要需要考慮的是由于受儀器、色譜柱、試劑、泵系統(tǒng)、檢測器等的影響很大，方法的靈敏度存在著很大的風險。因此，可以分析方法標準操作規(guī)程SOP中規(guī)定靈敏度溶液的信噪比作為檢測有效的系統(tǒng)適用性標準，參見參考文獻[3]提供的范例：以有關物質為例，如某組分的限度0.1%，方法驗證時0.05%水平下信噪比20，回收率驗證與精密度驗證均符合規(guī)定，該水平為日常檢測報告的最低值，則在系統(tǒng)適用性試驗中應確認該組分0.05%水平下信噪比不小于20。