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摘要  

 

系統(tǒng)適用性是色譜工作中必不可少的部分，國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)都對(duì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)做了要求。本文是筆者對(duì)色譜實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)適用性的漫談，供廣大讀者在工作閑暇之處討論，不足之處還望理解。

 

系統(tǒng)適用性是液相和氣相色譜方法的重要組成部分，用來(lái)確認(rèn)色譜系統(tǒng)的分離度和重復(fù)性能夠滿足特定的分析要求。測(cè)試是基于將儀器、電路、實(shí)驗(yàn)者和樣品作為一個(gè)整體進(jìn)行的。

 

美國(guó)藥典規(guī)定任何色譜試驗(yàn)一定要進(jìn)行系統(tǒng)適用性測(cè)試，否則，這臺(tái)儀器做出的數(shù)據(jù)一律無(wú)效；ICH提出一定要將系統(tǒng)作為整體來(lái)測(cè)試；FDA提到應(yīng)確定一SOP進(jìn)行測(cè)試確保系統(tǒng)可用；英國(guó)藥典規(guī)定建立系統(tǒng)適用性是為了任何使用方法時(shí)都是有效的；歐洲藥典提出系統(tǒng)適用性測(cè)試反映了色譜系統(tǒng)性能，是建立分析方法不可或缺的一部分；日本藥典與美國(guó)藥典敘述基本一致；GMP指出檢查分析方法驗(yàn)證過(guò)程時(shí)，應(yīng)涉及是否開發(fā)了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，并且對(duì)每一項(xiàng)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的參數(shù)都進(jìn)行了定義；中國(guó)藥典并沒(méi)有單獨(dú)對(duì)系統(tǒng)適用性目的進(jìn)行敘述，國(guó)內(nèi)色譜工作者往往對(duì)系統(tǒng)適用性不夠重視，看似簡(jiǎn)單的系統(tǒng)適用性其實(shí)有很多需要關(guān)注的地方，其重要性不比方法學(xué)中其他驗(yàn)證項(xiàng)差。

 

一、美國(guó)藥典系統(tǒng)適用性的要求

 

美國(guó)藥典并沒(méi)有明確對(duì)分離度、理論塔板數(shù)、拖尾因子、重復(fù)性及靈敏度的統(tǒng)一要求，在藥典正文中各個(gè)品種項(xiàng)下分別規(guī)定。當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液需要重復(fù)進(jìn)樣以判斷系統(tǒng)的精密度，除非個(gè)論中有規(guī)定，系統(tǒng)適用性5針的數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得超過(guò)2.0%，當(dāng)超過(guò)2.0%時(shí)，需要計(jì)算連續(xù)6針進(jìn)樣的數(shù)據(jù)。在含量測(cè)定中，系統(tǒng)適用性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與進(jìn)樣次數(shù)和含量限度上限有關(guān)，表1是USP對(duì)含量系統(tǒng)適用性測(cè)試相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的規(guī)定。

 

表1 USP對(duì)含量系統(tǒng)適用性RSD的要求

 

含量限度上限	進(jìn)樣次數(shù)
	3	4	5	6
	RSD%
101.0%				0.349
102.0%	0.41	0.59	0.73	0.85
102.5%	0.52	0.74	0.92	1.06
103.0%	0.62	0.89	1.10	1.27

 

關(guān)于對(duì)稱因子規(guī)定參考筆者撰寫《拖尾因子、對(duì)稱因子和不對(duì)稱因子區(qū)別理論》，在此不做贅述。當(dāng)系統(tǒng)適用性不符合要求時(shí)可以適當(dāng)調(diào)整方法參數(shù)，不過(guò)每個(gè)變量的最大值都應(yīng)該進(jìn)行驗(yàn)證其系統(tǒng)適用性，對(duì)改變后的方法進(jìn)行重新評(píng)價(jià)。表2是USP對(duì)參數(shù)調(diào)整的規(guī)定。

 

表2 USP對(duì)系統(tǒng)參數(shù)再調(diào)整的規(guī)定

 

參數(shù)	規(guī)定變化量
一般是不推薦改變流動(dòng)相組分，調(diào)整比例即可	僅能對(duì)最小溶劑組分的量進(jìn)行改變，不得超過(guò)相對(duì)量的±30%或絕對(duì)量的±10%
流動(dòng)相pH值	正負(fù)0.2個(gè)單位
在滿足pH值得情況下，緩沖鹽濃度波動(dòng)范圍	±10%
色譜柱長(zhǎng)度	±70%
液相色譜柱內(nèi)徑	與流速配合調(diào)整
氣相毛細(xì)管柱內(nèi)徑	±50%
液相色譜柱填料±粒徑	可以減少50%，但不能增大
氣相毛細(xì)管柱填料粒徑	根據(jù)需求增大或減少
氣相柱流量	±50%
液相流速	與色譜柱內(nèi)徑配合調(diào)整
波長(zhǎng)	不能做調(diào)整
液相進(jìn)樣體積	可以減少，但不能增加
氣相進(jìn)樣體積	可以適當(dāng)增大或減少
柱溫	±10%
進(jìn)樣口溫度	±10%
程序升溫	±20%

 

二、歐洲藥典和英國(guó)藥典系統(tǒng)適用性的要求

 

歐洲藥典和英國(guó)藥典對(duì)系統(tǒng)適用性要求也做了非常詳細(xì)的規(guī)定，并且對(duì)保留時(shí)間、保留體積、死體積、死時(shí)間等概念做了詳細(xì)描述。EP和BP關(guān)于對(duì)稱因子規(guī)定參考筆者撰寫《拖尾因子、對(duì)稱因子和不對(duì)稱因子區(qū)別理論》，在此不做贅述。系統(tǒng)適用性5針的數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與USP規(guī)定基本一致。當(dāng)系統(tǒng)適用性不符合要求時(shí)可以適當(dāng)調(diào)整方法參數(shù)，EP和BP對(duì)等度洗脫和梯度洗脫分別做了規(guī)定，詳見表3。

 

表3 EP和BP對(duì)系統(tǒng)參數(shù)再調(diào)整的規(guī)定

 

類型	參數(shù)	規(guī)定變化量
等度洗脫	流動(dòng)相組分	最小溶劑組分的量改變時(shí)，不得過(guò)相對(duì)量的±30%，或者絕對(duì)量的±2%，以數(shù)字大者為準(zhǔn)，但不得過(guò)±30%
	流動(dòng)相pH值	正負(fù)0.2個(gè)單位
	流速	±50%，可以隨柱尺寸改變
	柱參數(shù)	固定相不得改變，粒徑可以減少50%，不得增加
	柱尺寸	長(zhǎng)度改變±70%，內(nèi)徑可以改變±25%
	柱溫	±10℃
	波長(zhǎng)	不得改變
	進(jìn)樣量	可以減少，不得增加
梯度洗脫	流動(dòng)相組分	更換后組分洗脫能力要增強(qiáng)，主峰保留時(shí)間改變±15%
	流動(dòng)相pH值	不得改變
	流動(dòng)相鹽濃度	±10%
	流速	與等度洗脫一致
	柱尺寸	固定相不得改變，粒徑不得改變，長(zhǎng)度和內(nèi)徑與等度一致
	柱溫	±5℃
	波長(zhǎng)	不得改變
	進(jìn)樣量	與等度一致
氣相	毛細(xì)管柱粒徑	可減少50%，但不能增大尺寸
	毛細(xì)管柱膜厚	-50%~+100%
	毛細(xì)管長(zhǎng)度	±70%
	內(nèi)徑	±50%
	柱流量	±50%
	柱溫	±10%
	進(jìn)樣體積	根據(jù)需求可以增大或減少

 

三、日本藥典系統(tǒng)適用性要求

 

日本藥典要求在液相中的系統(tǒng)適用性一般重復(fù)進(jìn)樣6次，需要根據(jù)實(shí)際情況確定適合的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。比如6次進(jìn)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.0%，則要求雜質(zhì)含量不得大于5.0%，含量應(yīng)在98.0%~102.0%范圍內(nèi)。雜質(zhì)含量在0.5%~1.0%范圍內(nèi)，則要求系統(tǒng)適用性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%。不過(guò)，在利用梯度方法或者樣品包含強(qiáng)保留組分時(shí)，可以適當(dāng)減少進(jìn)樣次數(shù)來(lái)確定新的接受限度以滿足系統(tǒng)適用性，表4是不同進(jìn)樣次數(shù)對(duì)應(yīng)6次進(jìn)樣的限度規(guī)定。

 

表4 不同進(jìn)樣次數(shù)對(duì)應(yīng)6次進(jìn)樣的限度規(guī)定

 

進(jìn)樣次數(shù)	RSD%
6	1%	2%	3%	4%	5%	10%
5	0.88%	1.76%	2.64%	3.52%	4.40%	8.81%
4	0.72%	1.43%	2.15%	2.86%	3.58%	7.16%
3	0.47%	0.95%	1.42%	1.89%	2.37%	4,73%

 

上述要求均指在液相中，對(duì)于氣相色譜可以適當(dāng)放寬。JP并沒(méi)有單獨(dú)對(duì)理論塔板數(shù)、拖尾因子及分離進(jìn)行規(guī)定，而是在藥典正文各個(gè)品種下進(jìn)行規(guī)定。當(dāng)系統(tǒng)適用性不符合要求時(shí)可以適當(dāng)調(diào)整方法參數(shù)，JP并沒(méi)有像USP、EP及BP一樣進(jìn)行詳細(xì)規(guī)定，只是簡(jiǎn)單敘述可以從色譜柱、流動(dòng)相、柱溫等進(jìn)行改變以適應(yīng)系統(tǒng)適用性要求。

 

四、中國(guó)藥典系統(tǒng)適用性的要求

 

中國(guó)藥典要求定量分析時(shí)，分離度應(yīng)大于1.5。進(jìn)行重復(fù)性分析，采用外標(biāo)法時(shí)，取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%，采用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，配制80%、100%和120%對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計(jì)算平均校正因子，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%。拖尾因子規(guī)定參考筆者撰寫《拖尾因子、對(duì)稱因子和不對(duì)稱因子區(qū)別理論》，在此不做贅述。當(dāng)系統(tǒng)適用性不符合要求時(shí)可以適當(dāng)調(diào)整方法參數(shù)，ChP同樣對(duì)參數(shù)改變做了要求。表5是ChP對(duì)系統(tǒng)參數(shù)在調(diào)整規(guī)定。

 

表5  ChP 對(duì)系統(tǒng)參數(shù)在調(diào)整規(guī)定

 

參數(shù)	規(guī)定變化量
固定相種類	不可變化
流動(dòng)相種類	不可變化
檢測(cè)器類型	不可變化
流動(dòng)相比例	以組分比例較低者（小于等于50%）相對(duì)于自身的該變量不超過(guò)±30%，改變總量不超過(guò)±10%，總量以10%為限
進(jìn)樣量	根據(jù)需求改變
柱溫	根據(jù)需求改變
色譜柱尺寸	根據(jù)需求改變
流速	根據(jù)需求改變

 

五、筆者對(duì)系統(tǒng)適用性的要求

 

筆者在進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)時(shí)會(huì)依據(jù)情況而定，如果含量和有關(guān)物質(zhì)是一種方法，則只需要進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。反之，則應(yīng)區(qū)別對(duì)待。對(duì)于含量的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)應(yīng)配制規(guī)定樣品濃度的主成分，添加所有已知雜質(zhì)進(jìn)樣6次重復(fù)進(jìn)樣試驗(yàn)，首先要求6次進(jìn)樣的雜質(zhì)與主成分的分離度均大于2.0，并且主成分的拖尾因子應(yīng)在0.95~1.05之間，理論塔板數(shù)可根據(jù)實(shí)際情況酌情而定（比如色譜柱性能變差則峰形變平等等）。再者就是6次進(jìn)樣的主成分的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.0%，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.0%。

 

對(duì)于等度洗脫方法或者已確定各雜質(zhì)保留時(shí)間足夠穩(wěn)定，可以采用上述混合溶液?jiǎn)吾樳M(jìn)樣，考察分離度、理論塔板數(shù)及拖尾因子，再以主成分對(duì)照品溶液行3次連續(xù)進(jìn)樣兩兩計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于1.0%，或者6次連續(xù)進(jìn)樣的峰面積及保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于1.0%以確定系統(tǒng)滿足測(cè)定要求。有關(guān)物質(zhì)的系統(tǒng)適用性應(yīng)制備混有至少大于限度濃度雜質(zhì)的主成分對(duì)照品溶液進(jìn)行1次進(jìn)樣，根據(jù)實(shí)際情況確定分離度、拖尾因子及理論塔板數(shù)要求，再按照含量系統(tǒng)適用性測(cè)試中對(duì)照品方法進(jìn)行測(cè)定即可。

 

系統(tǒng)適用性樣品

 

系統(tǒng)適用性應(yīng)使用經(jīng)過(guò)確認(rèn)的一級(jí)或二級(jí)對(duì)照品和任何必要的物料進(jìn)行系統(tǒng)適用性檢查，以確保足夠的方法性能。一個(gè)新批次高度純化的對(duì)照物料（例如來(lái)自化學(xué)品供應(yīng)商或自制）應(yīng)采用一級(jí)對(duì)照品進(jìn)行確認(rèn)。未確認(rèn)為對(duì)照品的制劑或API不應(yīng)用于系統(tǒng)適用性測(cè)試。即使API或制劑經(jīng)過(guò)恰當(dāng)確認(rèn)成為對(duì)照品，如果是來(lái)自待檢樣品相同批次，則亦不能用于系統(tǒng)適用性測(cè)試。所以我們?nèi)粘Ｋ幬锓治龉ぷ髦惺遣荒苡霉┰嚻纷鳛橄到y(tǒng)適用性樣品的，采用供試品進(jìn)行系統(tǒng)適用性測(cè)試具有直到檢測(cè)合格為止的嫌疑。 

 

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)什么時(shí)候做

 

何時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)適用性因人而異，每個(gè)人都有一套自己的標(biāo)準(zhǔn)，筆者認(rèn)為在系統(tǒng)發(fā)生變動(dòng)時(shí)都要進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（比如新配制流動(dòng)相、比如更換同型號(hào)新購(gòu)色譜柱、比如更換氣體），還有在長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行運(yùn)行樣品時(shí)也及時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)適用性封針操作。方法驗(yàn)證試驗(yàn)一定包括系統(tǒng)適用性測(cè)試。正如前文所說(shuō)，沒(méi)有進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的系統(tǒng)任何數(shù)據(jù)都是無(wú)效的。

 

 結(jié)語(yǔ) 

 

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)作為分析方法不可分割的一部分，已經(jīng)被越來(lái)越多的監(jiān)管機(jī)構(gòu)所重視。不過(guò)從目前國(guó)內(nèi)整體的藥物研發(fā)情況來(lái)看，藥物分析工作者對(duì)此還沒(méi)有足夠的認(rèn)識(shí)，未結(jié)合分析方法驗(yàn)證情況有針對(duì)性地去探索系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。在有藥典參考標(biāo)準(zhǔn)的情況下，對(duì)藥典標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)適用性要求不夠重視，僅僅將色譜條件拿來(lái)使用，或者隨意更改、降低系統(tǒng)適用性要求，導(dǎo)致方法的重現(xiàn)性差，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。在這方面，藥物分析工作者們急需提升觀念，提高重視程度，加強(qiáng)研究。

 

參考文獻(xiàn)

 

【1】美國(guó)藥典

【2】歐洲藥典

【3】英國(guó)藥典

【4】日本藥典

【5】中國(guó)藥典

【6】Comparison of System Suitability Test for Liquid Chromatography in Pharmacopoeias [J].,2013,027(012):1305-1307.

【7】《Data Integrity and Compliance With Drug CGMP》

【8】李飛, 李云, 許真玉. 色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)在分析方法使用中的重要性[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2019, 28(06):30-33.