中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

做DNA提取及含量測(cè)定是，你是否一次成功，有沒(méi)有遇到過(guò)奇怪的問(wèn)題，一起來(lái)看看前輩的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，跟小析姐一起get技能，無(wú)懼實(shí)驗(yàn)！

 

DNA提取

 

制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟,通常要求得到的片段的長(zhǎng)度不小于100-200kb。在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素,以保證DNA的完整性,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。主要是CTAB方法,其他的方法有:1、物理方式:玻璃珠法,超聲波法,研磨法,凍融法。2、化學(xué)方式:異硫氰酸胍法,堿裂解法3、生物方式:酶法。根據(jù)核酸分離純化方式的不同有:硅質(zhì)材料、陰離子交換樹(shù)脂等。下面介紹一下本實(shí)驗(yàn)室常用的幾種方法。

 

(一)經(jīng)典DNA提取方法——酚氯提取法:

 

試驗(yàn)原理: 

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑,反復(fù)抽提,使蛋白質(zhì)變性,SDS(十二烷基磺酸鈉)將細(xì)胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子,核蛋白變性降解,使DNA從核蛋白中游離出來(lái)。DNA易溶于水,不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán),也容易進(jìn)行水合作用,并在表面形成一層水化層,使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時(shí),蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞,變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相),DNA存在于上層水相中,蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質(zhì)。氯仿的作用是有助于水相與有機(jī)相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍體積的無(wú)水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA,回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的鹽,真空干燥,用TE緩沖液溶解DNA備用。

 

具體步驟:

取枸櫞酸鈉抗凝外周血2ml加8ml 1×紅細(xì)胞裂解液放在15ml離心管中,冰上放置30min,至溶液透明,3000rpm離心10min,去除上清。加1×紅細(xì)胞裂解液4ml,充分混勻, ,3000rpm離心10min,去除上清,加100μl 20%SDS,加30μl 20mg/ml的蛋白酶k搖勻, 37℃搖床過(guò)夜(>8h)。加等體積飽和酚至上述樣品處理液中,溫和充分混勻,靜置10分鐘, 離心3000rpm×10min,取上層水相到另一1.5ml離心管中,加等體積飽和酚,混勻,離心3000rpm×10min,取上層水相到另一管中。加等體積酚/氯仿(1:1),輕輕混勻,離心3000rpm×10min,取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重復(fù)此步驟數(shù)次。加等體積氯仿,輕輕混勻,離心3000rpm×10min 。取上層水相到另一管中, 加2倍體積的無(wú)水乙醇及少量生理鹽水,輕輕倒置混勻。待絮狀物出現(xiàn)后,離心12000rpm×10min,棄上清液。沉淀用75%乙醇洗滌,離心12000rpm×10min ,棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)乙醇,待沉淀將近透明后加TE水溶解過(guò)夜。Nanodrop 核酸定量分析儀測(cè)定DNA濃度并記錄,最后將所提DNA放置-20℃凍存。

 

(二)真核細(xì)胞DNA的制備:

 

一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-109bp,可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞,隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析,還可用于PCR的模板、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。

 

根據(jù)材料來(lái)源不同,采取不同的材料處理方法,而后的DNA提取方法大體類(lèi)似,但都應(yīng)考慮以下兩個(gè)原則: 

1、防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解。

2、盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。

 

具體步驟:

（1）試劑準(zhǔn)備:TE: 10mM Tris-HCl(pH7.8),1mM EDTA (pH8.0),TBS: 25mM Tris-HCl(pH7.4),200mMNaCl;5mMKCl,裂解緩沖液(250mMSDS,使用前加入蛋白酶K至100mg/ml),20%SDS,2mg/ml蛋白酶K,Tris飽和酚(pH8.0),酚/氯仿(酚∶氯仿=1∶1),無(wú)水乙醇,75%乙醇。

 

（2）新鮮或冰凍組織處理:取組織塊0.3-0.5cm3(大約100g) 剪碎,加TE 0.5ml,轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。加20%SDS 25ml,蛋白酶K (2mg/ml)25ml,混勻。60°C水浴1-3小時(shí)(根據(jù)樣本的情況可適當(dāng)增加水浴時(shí)間)。

 

（3）提取DNA: 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中,充分混勻3min。離心5000g×10min,取上層水相到另一1.5ml離心管中。加等體積飽和酚,混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中。加等體積酚/氯仿,輕輕混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重復(fù)此步驟數(shù)次。加等體積氯仿,輕輕混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中。加1/10體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的無(wú)水乙醇,輕輕倒置混勻。待絮狀物出現(xiàn)后,離心5000g×5min,棄上清液。沉淀用75%乙醇洗滌,離心5000g×3min,棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)乙醇,待沉淀將近透明后加50-100ulTE溶解過(guò)夜。

 

(三)DNA提取試劑盒制備DNA模板

 

DNA提取試劑盒是適用于PCR研究的快速提取DNA的方法,與經(jīng)典酚氯提取法相比,高效、快速的提取純度較高的DNA,操作過(guò)程簡(jiǎn)單,無(wú)毒無(wú)味,所需樣品材料的量較少;但價(jià)格較為昂貴,且產(chǎn)出DNA的量少。現(xiàn)今全血DNA提取試劑盒、細(xì)胞及組織DNA提取試劑盒等均已商品化,可在TIANGEN, 寶生物、QIAGEN等生物公司購(gòu)買(mǎi),其具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒中提供的說(shuō)明書(shū)操作,下面以唾液中DNA的制備為例,介紹DNA提取試劑盒(QIAamp Blood DNA Mini Kit)的使用步驟。

 

具體步驟:

1、0.5 mL唾液以1 mL PBS緩沖液(pH 7.4)重懸,3000g離心5分鐘,棄上清;

2、沉淀以200ml PBS緩沖液和20ml Protease重懸后,按QIAamp DNA Kit試劑盒使用要求制備DNA(洗脫體積50ml):加入200mL 裂解液AL,渦懸混合器處理15秒, 56℃ 水浴10min,離心機(jī)上甩一下, 加入200mL 無(wú)水乙醇,混勻, 轉(zhuǎn)入spin cloumn中, 6000g離心 1min, 棄濾出液,柱子中加入500ml AW1, 6000g 離心1min, 棄濾出液,加入500ml AW2, 20000g 離心3min, 棄濾出液, 將柱子中溶液置于新1.5ml EP管中,加入50ul AE,室溫或56℃靜置1-3min, 再次6000g 離心1min 收獲DNA。

 

DNA含量及純度的檢測(cè)

 

實(shí)驗(yàn)原理:

一種方法是通過(guò)凝膠電泳的方法檢測(cè)DNA的含量:取2-5μlDNA溶解液與0. 4μl 6×載樣緩沖液混合,用0.75%瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml)檢測(cè)。溴化乙錠可迅速嵌于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中,嵌入DNA中的溴化乙錠受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光,這種熒光強(qiáng)度與DNA總質(zhì)量數(shù)成正比,通過(guò)比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度,對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行定量。(詳見(jiàn)凝膠電泳)

 

另一方法是分光光度法,組成DNA的堿基,具有一定的吸收紫外線的特性,其最大吸收值在波長(zhǎng)250-270nm之間。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后,其吸收紫外線的特性沒(méi)有改變,核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm,利用DNA的這個(gè)物理特性來(lái)測(cè)定DNA的濃度。同時(shí)可以檢測(cè)280nm處紫外吸收值,當(dāng)OD260/OD280的值在1.8-2.0之間時(shí)DNA純度較好,排除蛋白等的污染,可用于PCR等DNA質(zhì)量要求較高的實(shí)驗(yàn)。

 

分光光度法的具體方法是

 

1、取兩只清潔的比色杯,各加入2ml 0.1mol/L TE校正零點(diǎn)。

2、以其中的一只比色杯作為空白對(duì)照,在另一只比色杯中加入4μlDNA溶液,再加入0.1mol/L TE至2ml混勻(V/V=1:8)。

3、測(cè)定波長(zhǎng)為260nm時(shí)的OD值,再將波長(zhǎng)調(diào)至280nm測(cè)其OD值。

4、根據(jù)OD260=1時(shí),雙鏈的DNA濃度為50μg/ml,單鏈DNA或RNA濃度為40μg/ml,按計(jì)算公式:樣品DNA濃度(μg/ml)=OD260×40μg/ml×稀釋倍數(shù),計(jì)算樣品的DNA濃度。

現(xiàn)今實(shí)驗(yàn)室使用nanodrop核酸定量分析儀檢測(cè)DNA的含量和純度,僅需 2μl DNA溶液便可檢測(cè)出所需數(shù)據(jù),并有紫外吸收?qǐng)D譜。

 

DNA提取的注意事項(xiàng)

 

1、裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進(jìn)DNA溶解。

2、酚一定要堿平衡,使用平衡飽和酚。苯酚具有高度腐蝕性,飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會(huì)造成損傷,因此應(yīng)注意防護(hù)。氯仿易燃、易爆、易揮發(fā),具有神經(jīng)毒作用,操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。

3、各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解。

4、取各上清時(shí),不應(yīng)貪多,以防非核酸類(lèi)成分干擾。

5、異丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要預(yù)冷,以減少DNA的降解,促進(jìn)DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、提取DNA過(guò)程中所用到的試劑和器材要通過(guò)高壓烤干等辦法進(jìn)行無(wú)核酸酶化處理。

7、所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。

8、用大口滴管或吸頭操作,以盡量減少打斷DNA的可能性。

9、要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過(guò)降低內(nèi)切酶的活性DNA的降解。

10、避免劇烈吸打DNA,不能攪動(dòng)基因組DNA。

11、吸取基因組DNA時(shí),要用專(zhuān)用的粗口吸頭,普通吸頭可能會(huì)切斷DNA或造成DNA缺口。

12、在準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中,應(yīng)將DNA樣品放在碎冰上。

13、加緩沖液后,為了加速DNA溶解,可以輕輕晃動(dòng)或輕彈試管。

14、加入緩沖液后,置于4度過(guò)夜,也可以溶解DNA。

15、將DNA溶液65度溫育10分鐘,可以滅活DNase。

16、在抽提過(guò)程中如果水相和有機(jī)層的界面不太清楚,說(shuō)明其中蛋白質(zhì)含量較高,可增加酚/氯仿抽提的次數(shù)或適當(dāng)延長(zhǎng)離心的時(shí)間。

17、酚抽提時(shí)如果上清液太粘稠,無(wú)法進(jìn)行水相轉(zhuǎn)移時(shí),可加入適量TES稀釋后再抽提。