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定量分析比較常用的定量方法：

 

① 面積歸一化法

 

（可確定大概濃度，誤差大）

 

② 矯正面積歸一化法

 

（用響應(yīng)因子對(duì)峰面積修正）

 

③ 內(nèi)標(biāo)法

 

④ 外標(biāo)法

 

⑤ 混標(biāo)

 

面積歸一化法

 

若各組分的定量校正因子相近或相同，則上式可簡(jiǎn)化為：

 

 

 

不需要標(biāo)樣

 

組分的靈敏度相近

 

得到大致濃度（不能用于精確定量）

 

校正歸一化法

 

【推導(dǎo)】

 

 

 

用校正因子進(jìn)行修正后，再面積歸一化

 

 

需要所有組分的標(biāo)樣

 

內(nèi)標(biāo)法

 

在待測(cè)的樣品中準(zhǔn)確加入一定量的內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的量及其在色譜圖相應(yīng)的峰面積，確定此被測(cè)組分的含量。

 

原理:利用被測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物校正因子的比值不變來進(jìn)行定量的。

 

應(yīng)先用被測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，求得定量響應(yīng)因子或校正因子，然后再根據(jù)峰面積對(duì)樣品定量。

 

優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求，已消除系統(tǒng)誤差。

 

缺點(diǎn)：

 

1）每次需要準(zhǔn)確稱量?jī)?nèi)標(biāo)物和樣品。

 

2）必須加一個(gè)組分進(jìn)到樣品，有可能增加面積測(cè)量誤差。

 

3）嚴(yán)格選擇內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

 

 

需要標(biāo)樣和內(nèi)標(biāo)物。

 

目標(biāo)組分和內(nèi)標(biāo)物被檢測(cè)到，就可定量。

 

可減小進(jìn)樣量的誤差對(duì)結(jié)果的影響。

 

【定量結(jié)果最為準(zhǔn)確】

 

內(nèi)標(biāo)物必須準(zhǔn)確添加入所有未知樣品中。

 

外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

 

1.用于常規(guī)分析

 

2.應(yīng)用范圍：當(dāng)試樣中各組分都能流出色譜柱，且在檢測(cè)器上均有響應(yīng)，各組分沒有重疊時(shí)，可用此法。

 

3.優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，計(jì)算方便。

 

4.缺點(diǎn)：結(jié)果的準(zhǔn)確度取決于進(jìn)樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。該法必須定量進(jìn)樣。

 

（為提高精度，可將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中。）

 

注意事項(xiàng)：

 

要求進(jìn)樣量必須完全一致，是屬于絕對(duì)法。絕對(duì)響應(yīng)值的使用也是要求進(jìn)樣量、色譜質(zhì)譜分析操作條件嚴(yán)格不變。

 

檢測(cè)方法：

 

配置一系列已知濃度的標(biāo)樣，濃度按從小大排列；

 

采集不同濃度標(biāo)樣的色譜圖積分，按外標(biāo)法定量計(jì)算，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

 

 

特點(diǎn)：

 

無需各組分都被檢出、洗脫

 

需要標(biāo)樣

 

標(biāo)樣及樣品測(cè)定的條件要一致

 

進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確

 

 

校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點(diǎn)都可能引起計(jì)算錯(cuò)誤。

 

5.單點(diǎn)矯正：當(dāng)被測(cè)試樣中各組分的濃度變化范圍不大時(shí)而用單點(diǎn)校正法。即配置一個(gè)與被測(cè)組分含量十分接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液，定量進(jìn)樣，計(jì)算被測(cè)物的含量。

 

 

定量中的誤差問題

 

• 樣品的代表性（樣品的前處理）

 

• 進(jìn)樣系統(tǒng)的影響 

 

• 柱系統(tǒng)的影響

 

• 測(cè)量誤差 

 

• 定量結(jié)果的誤差分析

 

HPLC定量時(shí)，如何應(yīng)對(duì)非線性響應(yīng)的檢測(cè)器？

 

 

曲線A：因在0濃度時(shí)仍有色譜峰，可能有雜質(zhì)未分開；

 

曲線B：在此濃度范圍內(nèi)，檢測(cè)器的響應(yīng)是非線性的；

 

曲線C：可接受的理想狀態(tài)（其延長(zhǎng)線到0點(diǎn)）；

 

曲線D：表明有樣品的損失，可能是色譜柱的非特征吸附，也可能是樣品制備時(shí)損失。

 

非線性響應(yīng)：測(cè)試當(dāng)中，如果其輸出不與其輸入成正比,則它是非線性的.從數(shù)學(xué)上看,非線性系統(tǒng)的特征是疊加原理不再成立，需要做特殊處理。

 

 

在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，做響應(yīng)值與組分量間的關(guān)系圖

 

1）圖中曲線的斜率為1±0.05時(shí)，為線性響應(yīng)（A）；

 

2）斜率大于或小于1±0.05時(shí)（B、C），均為非線性響應(yīng)。

 

案例：貝殼中提取物的定量

 

（非線性響應(yīng)）

 

UHPLC測(cè)試條件

 

流動(dòng)相：乙腈：0.05%三乙胺溶液=75：25，流速1ml/min

 

檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射（霧化60度，蒸發(fā)85度，靈敏度5，高等）

 

色譜柱：Supersil ODS2（4.6mm*25cm)

 

 

貝殼中貝母素A、B的HPLC測(cè)試圖

 

 

貝母素A的曲線圖

（濃度與峰面積）非線性

 

 

貝母素A的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

（濃度對(duì)數(shù)與峰面積對(duì)數(shù)）