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藥代動(dòng)力學(xué)（Drug metabolism and Pharmacokinetics）是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、排泄和代謝規(guī)律的一門(mén)學(xué)科，是新藥設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)各個(gè)階段的關(guān)鍵組成部分。本文主要介紹了在新藥發(fā)現(xiàn)階段DMPK高通量篩選方法，及分享各大制藥企業(yè)的DMPK篩選評(píng)價(jià)策略。

 

新藥研發(fā)失敗分析

 

據(jù)Daniela Schuster和Christian Laggner統(tǒng)計(jì)（圖1）[1]，在1964-1985年期間，DMPK導(dǎo)致的失敗接近40%。自20世紀(jì)80年代起，藥代動(dòng)力學(xué)研究受到跨國(guó)制藥公司的高度重視，并越來(lái)越早的介入到藥物設(shè)計(jì)、篩選和評(píng)價(jià)中。數(shù)據(jù)證明，這部分投資是值得的，在1992-2002年期間，臨床Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期因DMPK導(dǎo)致終止的分別為14%、17%和4%（圖2）[1]。Ismail Kola 和 John Landis的研究結(jié)果顯示（圖3）[2] 1991-2000年在新藥開(kāi)發(fā)階段，因DMPK導(dǎo)致的失敗率從近40%降低至10%左右。隨著DMPK技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，在2008-2010年臨床Ⅱ期因DMPK導(dǎo)致的失敗率進(jìn)一步降低至1%(圖4)[3,4]，而2011-2015年的數(shù)據(jù)顯示臨床Ⅱ期和Ⅲ期沒(méi)有因DMPK導(dǎo)致的失敗[5,6]。這些數(shù)據(jù)充分說(shuō)明了DMPK在新藥研發(fā)中的重要性，在早期進(jìn)行DMPK研究可避免后期DMPK導(dǎo)致的失敗，降低后期開(kāi)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用。

 

 

圖1. 1964-1985年，新藥研發(fā)失敗的原因（n=198）

 

 

圖2. 1992-2002年，藥物在臨床Ⅰ（左）、Ⅱ（中）、Ⅲ（右）終止開(kāi)發(fā)的原因

 

 

圖3. 新藥研發(fā)失敗原因(1991–2000). 

 

 

圖4. 2008–2010臨床II 期失敗 (a) 失敗原因（b）治療領(lǐng)域

 

DMPK臨床前研究目的

 

為了取得商業(yè)上的成功或者具有臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，一個(gè)理想的藥物需有合適的給藥劑量和給藥方案，與其他藥物合用不需要進(jìn)行劑量調(diào)整。以口服藥物為例，則是要求化合物高溶高滲，生物利用度高，有合適的半衰期，沒(méi)有藥物-藥物相互作用。為了得到這樣的候選化合物，在新藥篩選和優(yōu)化階段就需要采用合適的DMPK篩選方法和評(píng)價(jià)策略，并達(dá)到兩個(gè)目的：1）建立定量結(jié)構(gòu)-性質(zhì)相關(guān)性（QSPR），幫助化合物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以優(yōu)化DMPK性質(zhì)。2）建立體內(nèi)-體外相關(guān)性，以通過(guò)體外數(shù)據(jù)并結(jié)合藥性和安全性預(yù)測(cè)臨床情況。下面就重點(diǎn)介紹一下工業(yè)界常用的DMPK篩選和評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/span>

 

DMPK高通量篩選方法

 

體外代謝穩(wěn)定性研究

 

許多在體外顯示高活性的化合物由于其不良的代謝特性，而在體內(nèi)無(wú)效或由于反應(yīng)性代謝物產(chǎn)生毒性而失去開(kāi)發(fā)價(jià)值。因此，合理的藥物設(shè)計(jì)應(yīng)考慮到藥物代謝途徑及相關(guān)的藥物代謝酶，發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的代謝弱點(diǎn)，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以增加代謝穩(wěn)定性或降低毒性。在新藥發(fā)開(kāi)階段可以先用各種體外模型對(duì)化合物的代謝特性進(jìn)行篩選，以確定其是否有繼續(xù)開(kāi)發(fā)的價(jià)值。常用的體外代謝研究模型主要有肝微粒體、S9、肝細(xì)胞、肝組織勻漿、各種重組酶、血漿、全血等。藥物的代謝反應(yīng)主要包括氧化、還原、水解及結(jié)合等，參與生物轉(zhuǎn)化的主要代謝酶分別見(jiàn)表1和表2。在化合物篩選階段，可根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及可能的代謝途徑選擇一種或兩種代謝體系進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。由于CYP450酶參與了近70%藥物的代謝，而CYP450主要分布于肝微粒體上，且肝微粒體相較于S9和肝細(xì)胞又比較經(jīng)濟(jì)并易于儲(chǔ)存，故最常用肝微粒體+NADPH體系篩選化合物。當(dāng)化合物結(jié)構(gòu)式判斷，所研究項(xiàng)目的化合物主要經(jīng)非微粒體酶代謝時(shí)則需采用其他體外實(shí)驗(yàn)體系。譬如化合物含羧基，則化合物可能發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)，而前期肝微粒體和肝細(xì)胞穩(wěn)定性的結(jié)果表明該系列化合物確實(shí)主要發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝，則可以選用肝微粒+ NADPH+UDPGA體系或肝細(xì)胞體系進(jìn)行高通量篩選。又如篩選的化合物是前藥，主要經(jīng)酯酶代謝為原藥，經(jīng)確認(rèn)化合物在PBS中穩(wěn)定后，則需要考察化合物在血漿和肝微粒體中的穩(wěn)定性，并測(cè)定原藥的生成率。

 

化合物篩選階段，進(jìn)行代謝穩(wěn)定性研究的目的就是1. 考察化合物代謝穩(wěn)定性，將不穩(wěn)定的化合物篩掉；2. 確定種屬差異，藥效模型種屬（如大鼠）和人代謝均比較穩(wěn)定的可考慮繼續(xù)開(kāi)發(fā)。如果化合物在人肝微粒體中穩(wěn)定，在大鼠肝微粒體中很不穩(wěn)定，那么該化合物的有效性可能因?yàn)樵诖笫笾斜┞读坎蛔愣貌坏津?yàn)證，繼續(xù)開(kāi)發(fā)存在風(fēng)險(xiǎn)；如果化合物在大鼠肝微粒體中穩(wěn)定，但在人肝微粒體中很不穩(wěn)定，那么這種化合物很可能在大鼠疾病模型中展示較好的藥效，繼續(xù)開(kāi)發(fā)在臨床上可能因?yàn)槿梭w暴露量不足而導(dǎo)致藥效不足。3. 判斷代謝軟位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造；4. 建立體外清除率和體內(nèi)清除率的相關(guān)性，確定相關(guān)性良好則可用體外代謝模型進(jìn)行大量化合物的篩選，可加快篩選速度并可減少動(dòng)物PK實(shí)驗(yàn)而節(jié)約費(fèi)用。

 

表1. 藥物的氧化、還原和水解酶

 

 

表2. 藥物的結(jié)合代謝酶

 

 

小腸的吸收評(píng)價(jià)

 

目前常用于評(píng)價(jià)藥物的滲透性和小腸吸收的有Caco-2細(xì)胞系和PAMPA人工膜。其中PAMPA是基于被動(dòng)擴(kuò)散方式的吸收評(píng)價(jià)模型，成本低、通量高。Caco-2細(xì)胞株是研究藥物小腸吸收最常用的上皮細(xì)胞株，來(lái)源于人類(lèi)結(jié)腸腺癌細(xì)胞，具有和小腸上皮相似的形態(tài)和功能，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下細(xì)胞能自動(dòng)分化，緊密連接，表達(dá)多種刷狀緣酶、一些P450同工酶及幾種II相代謝酶，還表達(dá)多種轉(zhuǎn)運(yùn)體統(tǒng)，如糖類(lèi)、氨基酸、二肽、膽酸及維生素B12等內(nèi)源性因子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)體。此外，Caco-2還表達(dá)小腸上存在的多種藥物外排蛋白如P-糖蛋白、BCRP、MRP1等。Caco-2細(xì)胞株的分化程度極高，培養(yǎng)在支持物上，正常培養(yǎng)21天即可完成自動(dòng)分化，分化后形成具有微絨毛以及緊密連接等類(lèi)似于小腸上皮細(xì)胞刷狀緣測(cè)的分化特征的單細(xì)胞層[8]。因此，Caco-2細(xì)胞株可用于研究藥物結(jié)構(gòu)-口服吸收分?jǐn)?shù)的關(guān)系、預(yù)測(cè)化合物體內(nèi)吸收程度、研究吸收的機(jī)制、P-糖蛋白底物的篩選等。盡管Caco-2細(xì)胞能較好地模擬藥物的小腸吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，但也有一定的缺陷：⑴缺少腸壁的黏液層；⑵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平與正常小腸不一致；⑶代謝酶表達(dá)量與正常細(xì)胞有差別；⑷過(guò)緊的緊密連接。這些因素使得對(duì)于某些藥物而言，采用Caco-2細(xì)胞所得到的數(shù)據(jù)與其口服后在體內(nèi)吸收的相關(guān)性不理想。此外，由于不同實(shí)驗(yàn)室的Caco-2細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)方法不同，以至于所得出結(jié)論可比度較低。即使是同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞，也會(huì)因細(xì)胞傳代次數(shù)、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)介質(zhì)的不同而變化。因此，實(shí)驗(yàn)采用在一定代數(shù)范圍內(nèi)的細(xì)胞及規(guī)范的細(xì)胞培養(yǎng)方法，對(duì)于獲得數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性是非常重要的，并且需要使用二三十種低、中、高不同滲透性的模型藥物建立表觀滲透系數(shù)Papp與吸收程度的相關(guān)性，然后才可用于測(cè)定未知化合物的滲透性。

 

CYP450酶抑制研究

 

因藥物-藥物相互作用而導(dǎo)致的退市的例子有好幾個(gè)（表3），主要是因?yàn)镃YP450抑制而產(chǎn)生安全性問(wèn)題。在臨床開(kāi)發(fā)中，如果藥物可能存在相互作用的風(fēng)險(xiǎn)較大，也需要進(jìn)一步開(kāi)展臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)藥物的相互作用以確定臨床應(yīng)用是否需要進(jìn)行劑量調(diào)整[9]，這會(huì)增加臨床成本，也可能導(dǎo)致藥物上市后用藥不便或使用受限。因此，在新藥篩選和開(kāi)發(fā)階段評(píng)價(jià)藥物相互作用的可能性是非常必要的，尤其是臨床上很可能需合并用藥的，如降糖藥、降脂藥、降壓藥等，更應(yīng)盡可能避免產(chǎn)生藥物相互作用。由于70%的代謝性相互作用是由酶抑制導(dǎo)致的，在化合物篩選階段主要考察化合物對(duì)CYP450酶的抑制能力。其中CYP1A2、2C9、2C19、2D6和3A4/5參與了60%以上的藥物代謝，故高通量篩選時(shí)主要評(píng)價(jià)化合物對(duì)CYP1A2、2C9、2C19、2D6和3A4/5的抑制作用。常用CYP抑制實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)表4。

 

表3. 藥物相互作用導(dǎo)致退市的藥物

 

 

表4 CYP抑制試驗(yàn)方法

 

 

血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定

 

藥物進(jìn)入血液后，會(huì)與多種血液成分結(jié)合，如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板以及血漿蛋白。只有游離型的藥物才能透過(guò)生物膜進(jìn)入到組織或靶器官，產(chǎn)生效應(yīng)或進(jìn)行代謝和排泄，而結(jié)合型的藥物則起著類(lèi)似儲(chǔ)庫(kù)的作用。由于藥物在靶組織的游離濃度決定藥效，且血漿蛋白結(jié)合對(duì)藥物在體內(nèi)的分布和清除都有影響，因此在化合物篩選階段需要測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率。廣泛應(yīng)用的體外血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定方法有平衡透析法、超濾法和超速離心法，其中平衡透析法被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”。三種方法分別有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，詳見(jiàn)表5。對(duì)于非特異性吸附較大的化合物，首選超速離心法；對(duì)于在血漿中不太穩(wěn)定的化合物，首選超濾法；對(duì)于在血漿中不穩(wěn)定而且還存在非特性吸附的化合物，目前沒(méi)有特別有效的方法可以準(zhǔn)確測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率。

 

表5. 測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率方法的比較

 

 

體內(nèi)PK篩選方法

 

體外篩選模型具有速度快、成本低的特點(diǎn)，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)真實(shí)情況存在相關(guān)性的問(wèn)題，并且沒(méi)有動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)機(jī)體水平了解藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄是不夠的，因此開(kāi)展體內(nèi)PK研究也是十分必要的。與體外實(shí)驗(yàn)相比，體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究需要較長(zhǎng)的時(shí)間和較大強(qiáng)度的工作量，其通量往往比較低。

 

目前，加快藥物體內(nèi)PK篩選速度主要從兩個(gè)方面著手。首先是縮短當(dāng)個(gè)生物樣品定量分析的時(shí)間，提高分析通量；其次是針對(duì)現(xiàn)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行合理簡(jiǎn)化，在能夠得到有效信息的情況下，建立適用于篩選的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，減少需要分析的生物樣品數(shù)量。目前廣泛使用的UPLC-MS/MS技術(shù)，通常分析一個(gè)生物樣品的時(shí)間為2~4分鐘，分析速度已經(jīng)挺快了。為了進(jìn)一步提高通量，目前常用盒式給藥（Cassette dosing）方案，即將n個(gè)藥物配置成混合的給藥溶液再給予動(dòng)物。這該方案的優(yōu)勢(shì)是：大大減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量和生物樣品的數(shù)量，同時(shí)減輕了動(dòng)物技術(shù)員和生物樣品分析員的工作量，此外，在同一只動(dòng)物身上得到不同化合物的PK性質(zhì)，便于比較不同化合物的PK差異。這個(gè)方案的缺點(diǎn)是：需要找到合適的溶媒，保證這些化合物能夠同時(shí)給藥；其次是要建立多個(gè)化合物同時(shí)檢測(cè)的分析方法，加大了分析方法開(kāi)發(fā)和建立的難度；此外，藥物-藥物之間可能存在相互作用，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此要降低每個(gè)化合物的給藥劑量，并且引入已知PK性質(zhì)的基準(zhǔn)化合物作為陽(yáng)性對(duì)照。在實(shí)際工作中，一般是將3~5個(gè)化合物低劑量混合給藥，為了降低分析方法開(kāi)發(fā)的難度，各個(gè)化合物之間平均分子量相差4 Da以上。

 

以上介紹的都是工業(yè)界在新藥小分子篩選時(shí)廣泛運(yùn)用的一些實(shí)驗(yàn)方法，根據(jù)不同項(xiàng)目的特點(diǎn)，部分項(xiàng)目在前期篩選時(shí)還需進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)體研究、酶誘導(dǎo)研究、代謝表型鑒定、腦滲透性評(píng)價(jià)等。篇幅所限，就不一一介紹了。

 

DMPK篩選策略

 

筆者認(rèn)為在藥代動(dòng)力學(xué)研究中，難點(diǎn)不在于建立試驗(yàn)體系和開(kāi)展、完成相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)工作，而在于根據(jù)不同的項(xiàng)目特點(diǎn)制定DMPK篩選策略，以及如何解釋和應(yīng)用數(shù)據(jù)。

 

SureshK等[9]報(bào)道了Millennium在先導(dǎo)化合物優(yōu)化和候選化合物選擇的體外體內(nèi)ADME策略，見(jiàn)表6和圖5。Gary W.等[10]報(bào)道了R.W.Johnson在新藥發(fā)現(xiàn)早期和后期化合物優(yōu)化的臨床前研究范例。Peter Ballard等[11]報(bào)道了AstraZeneca在新藥發(fā)現(xiàn)階段整合的DMPK評(píng)價(jià)策略。Di Li等[12]闡述了Pfizer 在新藥發(fā)現(xiàn)階段CNS藥物腦滲透性的評(píng)價(jià)及篩選策略。

 

通過(guò)研究這些DMPK評(píng)價(jià)策略可知，在新藥發(fā)現(xiàn)階段，最重要的就是建立體外-體內(nèi)相關(guān)性，確定PK/PD關(guān)系，排除代謝物的安全性風(fēng)險(xiǎn)，推測(cè)人體PK、治療劑量及安全窗。 

 

表6. 不同階段的ADME實(shí)驗(yàn)

 

 

 

圖5. 從苗頭到先導(dǎo)及先導(dǎo)化合物優(yōu)化的迭代途徑

 

 

圖6. 新藥發(fā)現(xiàn)階段的ADME篩選流程及主要實(shí)驗(yàn)

 

表7. 各輪DMPK測(cè)試的實(shí)驗(yàn)及預(yù)估化合物數(shù)量

 

 

 

圖7. CNS藥物篩選流程

 

參考文獻(xiàn)

 

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