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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2021-11-26 21:36
摘要 目的：建立同時(shí)分析測(cè)定大川芎口服液中3種活性成分（天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I）的方法。方法：采用HPLC法，色譜柱為資生堂Capcell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈為流動(dòng)相A，0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為269 nm，322 nm。結(jié)果：天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I線性范圍分別9.525 0～381.00 μg·mL-1（r＝0.999 4），0.485 05～19.402 μg·mL-1（r＝0.999 9），2.1421～85.682 μg·mL-1（r＝0.999 9）；天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I回收率（n＝9）分別為93.9%、99.2%、99.8%，RSD均小于2.0%。結(jié)論：該法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，為控制大川芎口服液的質(zhì)量提供可靠的方法。
關(guān)鍵詞：大川芎口服液；梯度洗脫；HPLC
Abstract Objective： To establish a method for the simultaneous determination of three active ingredients （gastrodin，ferulic acid， senkyunolide I） in Dachuanxiong Oral Liquids. Methods： The chromatographic analysis was performed on a Shiseido Capcell C18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm）using a gradient elution of acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution delivered at a flow rate of 1.0 mL·min-1 at wavelengths of 269nm and 322 nm. Results： The calibration curves were linear in the ranges of 9.525 0-381.00 μg·mL-1 for gastrodin（r＝0.999 4），0.485 05-19.402 μg·mL-1 for ferulic acid（r＝0.999 9），2.1421-85.682 μg·mL-1 for senkyunolide I（r＝0.999 9）. The recovery values of gastrodin，ferulic acid and senkyunolide I （n＝9） were 93.9%， 99.2% and 99.8%，respectively， and RSD values were less than 2.0%. Conclusion：The method is simple and repeatable，which can be applied to the quality control of Dachuanxiong Oral Liquids.
Key words： Dachuanxiong Oral Liquids，gradient elution， HPLC
大川芎口服液由川芎、天麻經(jīng)水煎、醇沉等工藝精制而成，具有活血化瘀，平肝熄風(fēng)的功效。用于淤血阻絡(luò)，肝陽(yáng)化風(fēng)所致的頭痛、頭脹、眩暈、頸項(xiàng)緊張不舒、上下肢或偏身麻木、舌部瘀斑[1]?，F(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020年版一部，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)中僅對(duì)天麻的指標(biāo)成分天麻素[1]進(jìn)行控制，未控制川芎的有效成分，因此，建立簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、針對(duì)多組分的分析方法至關(guān)重要。川芎中化學(xué)成分主要包括川芎嗪、阿魏酸和藁本內(nèi)酯等化合物，川芎嗪一直被認(rèn)為是川芎中的主要活性成分，但近期研究表明，川芎中的內(nèi)酯類成分才是川芎的主要活性成分[2]，川芎內(nèi)酯類化合物能通過(guò)血腦屏障，具有抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、抗腦缺血、減輕腦缺血損傷等作用。前期的研究中[3]，從川芎抗偏頭痛效應(yīng)組分中分離得到了藁本內(nèi)酯的氧化衍生物洋川芎內(nèi)酯I。血清藥物化學(xué)研究表明，阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I為川芎效應(yīng)組分中入血的主要成分，洋川芎內(nèi)酯I為既入血又入腦的成分[4]。因此，選擇阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I作為川芎的有效成分進(jìn)行控制。目前，對(duì)大川芎口服液進(jìn)行質(zhì)量控制的文獻(xiàn)較少，但有大川芎方制劑類質(zhì)量控制的研究[5-6]，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，采用HPLC梯度洗脫法在同一色譜條件下對(duì)大川芎口服液中3種活性成分（天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I）同時(shí)測(cè)定，具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快捷的特點(diǎn)，可有效控制藥品質(zhì)量。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Waters 2695-2998高效液相色譜儀；Phenomen HU10260B型超聲波清洗器；Sartorius R200D型電子天平（十萬(wàn)分之一電子天平），Sartorius MSA6.6S-CE型電子天平（百萬(wàn)分之一電子天平）。
1.2 試劑及試藥
天麻素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110807-201608，純度為96.7%）、阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110773-201614，純度為99.0%）、洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品（南京金萌陽(yáng)生物科技有限公司提供，批號(hào)為17121105，純度為99.9%）；乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水；其它試劑為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 溶液的制備
2.1.1 對(duì)照品溶液
取天麻素對(duì)照品、阿魏酸對(duì)照品、洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1mL分別含100、5、20μg的混合溶液，即得。
2.1.2 供試品溶液
精密量取本品2 mL，置50mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
2.1.3 陰性樣品溶液
按工藝方法制備缺天麻、缺川芎、同時(shí)缺天麻和川芎的陰性樣品，并按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。
2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
色譜柱：資生堂Capcell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，2%A；12～50 min，2%A→40%A）；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：269 nm/322 nm；進(jìn)樣量：5 μL。理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，峰的分離度均大于1.5。在上述色譜條件下，樣品中其他成分對(duì)天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I的測(cè)定無(wú)干擾。對(duì)照品、供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。
2.3 方法學(xué)驗(yàn)證
2.3.1 線性關(guān)系考察
精密稱取阿魏酸對(duì)照品9. 799 mg，置100 mL量瓶中，用70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為阿魏酸對(duì)照品溶液；精密稱取洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品10.721mg，置50 mL量瓶中，用70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品溶液；精密稱取天麻素對(duì)照品19.700mg，置50mL量瓶中，分別精密加入阿魏酸對(duì)照品溶液10 mL和洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品溶液20mL，用70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液Ⅴ。取此混合對(duì)照品溶液配制系列濃度混合對(duì)照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I的回歸方程分別為：
Y＝1 056.8X＋5 959.2 r＝0.999 4
Y＝26 209.5X＋1 348.8 r＝0.999 9
Y＝22 926.2X＋2 878.6 r＝0.999 9
結(jié)果表明天麻素在9.525 0～381.00 μg·mL-1、阿魏酸在0.485 05～19.402 μg·mL-1、洋川芎內(nèi)酯I在2.1421～85.682 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
A. 對(duì)照品溶液（reference substance）（269 nm） B. 供試品溶液（sample）（269 nm） C. 缺天麻陰性液（negative sample without Gastrodiae elata Bl.）（269 nm） D. 缺川芎陰性液（negative sample without Rhizoma chuanxiong）（269 nm） E. 同時(shí)缺天麻川芎陰性液（negative sample without Gastrodia elata Bl. and Rhizoma chuanxiong）（269 nm） F. 對(duì)照品溶液（reference substance）（322 nm） G. 供試品溶液（test sample）（322 nm） H.缺川芎陰性液（negative sample without Rhizoma chuanxiong）（322 nm） I.空白溶劑（blank solvent）（269 nm） 1. 天麻素（gastrodin） 2. 阿魏酸（ferulic acid） 3. 洋川芎內(nèi)酯I（senkyunolideI）
圖1 HPLC色譜圖
Fig.1 HPLC chromatograms
2.3.2 耐用性試驗(yàn)
分別考察了30 ℃、35 ℃、40 ℃等3個(gè)柱溫條件；資生堂CapcellC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、安捷倫ZORBAX C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和奧泰 Alltima C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）3根色譜柱，結(jié)果對(duì)各色譜峰分離及各化學(xué)成分含量無(wú)明顯差異。
2.3.3 精密度試驗(yàn)
精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I的RSD分別為0.9%，1.0%，0.8%。表明儀器精密度良好。
2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)
精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、12、27h進(jìn)樣，結(jié)果天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I峰面積的RSD分別為1.0%，2.2%，2.3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液制備后27 h內(nèi)測(cè)定，待測(cè)組分天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。
2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批號(hào)的大川芎口服液樣品6份，每份2mL，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法試驗(yàn)，精密吸取供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果樣品中的天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I含量平均值分別為4 328.5，122.37，400.40 μg·mL-1；RSD分別為0.9%，2.9%，1.0%。表明方法重復(fù)性良好。
2.3.6 回收率試驗(yàn)
精密量取已知準(zhǔn)確含量的同一批樣品9份各1.0 mL（分成低中高濃度3組，每組3份，分別含天麻素4 328.5μg，阿魏酸122.37 μg，洋川芎內(nèi)酯I 400.40μ g），每份分別精密加入天麻素對(duì)照品溶液（精密稱取天麻素對(duì)照品40.69 mg，置100 mL量瓶，以70%甲醇溶液稀釋定容，濃度為393.47μg·mL-1），阿魏酸對(duì)照品溶液（精密稱取阿魏酸對(duì)照品12.05 mg，置100 mL量瓶中，以70%甲醇溶液稀釋定容，再取10mL，置100 mL容量瓶，以70%甲醇溶液稀釋定容，濃度為11.930μg·mL-1），洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品溶液（精密稱取洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品4.333mg，置100 mL量瓶中，以70%甲醇溶液稀釋定容，濃度為43.287μg·mL-1）5 mL、10 mL、15mL，按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成準(zhǔn)確度試驗(yàn)用供試品溶液，測(cè)定加標(biāo)樣品中的天麻素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。
2.4 樣品測(cè)定
取不同批號(hào)的大川芎口服液，分別按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。
3 討論
3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
兼顧3種成分紫外最大吸收波長(zhǎng)以及各組分在制劑中的含量，并查閱現(xiàn)有的相關(guān)文獻(xiàn)[9-13]，參照天麻素、洋川芎內(nèi)酯I紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，采用269nm波長(zhǎng)處測(cè)定天麻素、洋川芎內(nèi)酯I的含量；參照《中國(guó)藥典》2020年版川芎含量測(cè)定項(xiàng)，采用322nm波長(zhǎng)處測(cè)定阿魏酸的含量。
3.2 流動(dòng)相的選擇
分別考察了乙腈-0.05%磷酸溶液系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)，甲醇-0.1%冰醋酸溶液系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.05%磷酸溶液系統(tǒng)峰型較好，分離效果較理想。參照相關(guān)文獻(xiàn)的液相洗脫條件，最終確定梯度洗脫條件，本試驗(yàn)采用梯度洗脫法在50 min內(nèi)完成對(duì)3種成分的同時(shí)分析測(cè)定，縮短了分析時(shí)間。
3.3 小結(jié)
本文對(duì)處方中天麻及川芎的3個(gè)活性成分同時(shí)進(jìn)行定量研究，可以整體反映大川芎口服液的產(chǎn)品質(zhì)量，為該品種的質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支持。
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《中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)》雜志第22巻 第5期
施法1，董斌2，王天歌1，譚艷妮1，李成森3
（1. 沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，沈陽(yáng)110122；2. 大連市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧大連 116021；3. 遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心 遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，沈陽(yáng) 110036）
Simultaneous quantification of three active ingredients in Dachuanxiong Oral Liquids by HPLC
SHI Fa1，DONG Bin2， WANG Tiange1， TAN Yanni1， LI Chengsen3
（1. Shenyang Institute for Food and Drug Control， Shenyang 110122，China；2. Dalian Institute for Drug Control，Dalian 116021， China；3. Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110036，China）
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