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摘要: “?；?rdquo;是基因毒警示結(jié)構(gòu)，在含有水、醇或胺類等物質(zhì)環(huán)境中極不穩(wěn)定，分析方法開發(fā)難度極大，采用衍生化后測定是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，但是衍生化試劑如何選擇，非常關(guān)鍵，本文以氯磺酸異氰酸酯為例，展示分析方法開發(fā)全過程，不足和缺陷之處，望同行批評(píng)指正。

 

一、化合物性質(zhì)

 

 

本品具有 “?；?rdquo;基因毒警示結(jié)構(gòu)，易吸濕，在空氣中形成煙霧，遇水劇烈反應(yīng)生成氨基磺酸、氯化氫和二氧化碳。可溶于氯化烴、乙腈。沸點(diǎn)：107℃，分子量141.53。

“酰氯”在含有水、醇或胺類等物質(zhì)環(huán)境中極不穩(wěn)定。

 

二、衍生化試劑的選擇

 

思路1，采用小分子醇與其進(jìn)行衍生化生成酯，在通過GC-MS進(jìn)行采集，衍生機(jī)理如下：

 

 

結(jié)果：本品分別與甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇反應(yīng)，采用GC-MS進(jìn)行檢測，峰型良好，但方法靈敏度無法滿足1ppm的限度要求。

 

 

圖1：GC-MS譜圖

 

思路2，進(jìn)一步考慮選擇含芳香集基團(tuán)的醇或胺與其進(jìn)行衍生，然后采用LC-MS/MS方式進(jìn)行采集，衍生機(jī)理如下：

 

 

結(jié)果：采用氯磺酰異氰酸酯與苯胺衍生，以二氯甲烷為溶劑，產(chǎn)生的衍生物較多，以乙腈為溶劑（5%的甲醇助溶），產(chǎn)生的衍生物相對(duì)單

 

一，便于定量，譜圖如下所示：

 

 

圖以二氯甲烷為溶劑的衍生化結(jié)果

 

 

圖以乙腈為溶劑的衍生化結(jié)果

 

三、檢測方法的優(yōu)化

 

3.1、衍生化時(shí)間對(duì)產(chǎn)物的影響

 

氯磺酰異氰酸酯與苯胺反應(yīng)立即生產(chǎn)白色固體并伴有白霧，快速反應(yīng)，衍生時(shí)間考察5min，10min，20min。

 

 

結(jié)論：該反應(yīng)快速，5min已完成全部反應(yīng)，衍生時(shí)間的延長對(duì)衍生效果基本無影響。

3.2、衍生試劑用量對(duì)反應(yīng)的影響

取氯磺酰異氰酸酯約30mg，分別加入不同體積的衍生化試劑進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)衍生化試劑的反應(yīng)當(dāng)量，分別加入1倍反應(yīng)當(dāng)量，2倍反應(yīng)當(dāng)量及3倍反應(yīng)當(dāng)量。

 

 

結(jié)論：隨著衍生化試劑量的增加，衍生產(chǎn)物的量也隨之增加，當(dāng)加入量大于2倍理論量后，衍生產(chǎn)物的量基本不再增加，表明加入至少2倍理論量的衍生試劑時(shí)能保證衍生完全。

 

3.3、色譜條件的選擇

 

根據(jù)上述條件，進(jìn)一步進(jìn)行色譜條件的優(yōu)化：

條件一、流動(dòng)相：10mmol甲酸銨水溶液（用甲酸調(diào)節(jié)pH值3.5）-乙腈（45:55），柱溫30℃，流速0.3ml/min，進(jìn)樣量5μl，運(yùn)行時(shí)間5min，色譜柱，C18色譜柱（2.1*150mm，3μm），質(zhì)譜條件，電噴霧離子化源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM，290.2/170.9），離子源溫度300℃，脫溶劑管溫度250℃，霧化氣流速（N2）3L/min，加熱器流速15L/min，干燥器流速10L/min；CE電壓13.0V。

條件二、多反應(yīng)監(jiān)測（MRM，290.2/78.06），其他同條件一

條件三、反應(yīng)監(jiān)測（MRM，290.2/92.10），其他同條件一

 

 

結(jié)論：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM，290.2/170.9）條件下，方法靈敏度最高。

條件四、固定“多反應(yīng)監(jiān)測（MRM，290.2/170.9）”條件，CE電壓分別設(shè)定為13V、15V及20V。

 

 

結(jié)論：不同碰撞電壓，目標(biāo)組分的響應(yīng)差異不大，最終確定CE電壓為13V。

條件五、對(duì)照品溶液配制方式的選擇

采用加標(biāo)回收率的考察方式，評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)的影響，數(shù)據(jù)如下：

 

 

結(jié)論：根據(jù)上述結(jié)果可知，本方法測試具有基質(zhì)效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)中擬定采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。

 

四、方法預(yù)驗(yàn)證

 

對(duì)某原料中該雜質(zhì)進(jìn)行預(yù)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，本方法的專屬性良好，靈敏度可以達(dá)到0.5ppm的定量，回收率在80%-120%之間，方法可行。

 

 

五、參考文獻(xiàn)

 

[1]2020版《中國藥典》通則 9101.

[2]ICHM7.

[3]衍生化法測定酰胺類基因毒警示結(jié)構(gòu)雜質(zhì)的綜述.