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在臨床上，很難同時(shí)賦予植體良好的成骨能力和抗菌活性。細(xì)菌感染和與宿主組織的骨整合不足會(huì)延遲患者的恢復(fù)時(shí)間，增加術(shù)后發(fā)病率。早期植入成功的關(guān)鍵是骨細(xì)胞在植入物上的快速成骨分化和同時(shí)防止細(xì)菌感染。因此，開(kāi)發(fā)不使用抗生素的安全策略來(lái)預(yù)防細(xì)菌感染并同時(shí)增強(qiáng)骨整合是非常必要的。

天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院吳水林、河北工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院梁春永生命科學(xué)與健康工程學(xué)院劉響梅合作，采用激光熔覆和化學(xué)氣相沉積(CVD)法制備了HA/MoS2涂層改性Ti6Al4V (Ti6)的自激活植入物，以防止金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染，同時(shí)加速骨再生。HA/MoS2涂層通過(guò)從細(xì)菌中提取電子和改變細(xì)菌呼吸激活的代謝途徑來(lái)有效殺滅細(xì)菌，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)MSCs成骨分化，加速骨再生。相關(guān)工作以“Self-activating anti-infection implant”發(fā)表在《Nature Communications》。

圖1 細(xì)菌或MSCs-HA / MoS2-Ti6生物雜交系統(tǒng)設(shè)計(jì)，防止細(xì)菌感染，同時(shí)促進(jìn)骨組織再生

【HA/ MoS2-Ti6的表征及抗菌性能】

采用激光熔覆和化學(xué)氣相沉積的方法制備了HA/ MoS2-Ti6。HA/MoS2中Ca， P， Mo， S元素在涂層中均勻分布，表面形成了熔覆層且硫化成功，涂層中存在二硫化鉬。此外，HA成功地包覆了MoS2，激光熔覆和CVD處理后沒(méi)有形成空位。HA - ti6、MoS2-Ti6和HA/MoS2-Ti6表面親水性的改善歸因于激光熔覆工藝提高了植入體的表面粗糙度和HA中的羥基。通過(guò)激光熔覆和化學(xué)氣相沉積形成了HA/MoS2異質(zhì)結(jié)且處于固熔體狀態(tài)，界面接觸緊密。

細(xì)菌具有生物氧化還原電位(BRP)，其范圍為−4.12 eV ~−4.84 ev。而HA/ MoS2-Ti6的電位低于BRP，確保了電子從膜蛋白到HA/ MoS2-Ti6的平穩(wěn)轉(zhuǎn)移。通過(guò)在不同基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)菌，進(jìn)一步分析HA/ MoS2-Ti6與細(xì)菌之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)HA/ MoS2-Ti具有良好的廣譜抗菌性能，此外，HA/MoS2-Ti6組對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也有較強(qiáng)的抗菌能力。

圖2 HA/MoS2-Ti6的表征及抗菌性能

【HA/ MoS2-Ti6活化細(xì)菌死亡】

與6 h(金黃色葡萄球菌)和12 h(大腸桿菌)共孵育實(shí)驗(yàn)表明HA/ MoS2-Ti6在這些樣品中抗菌效果最好。進(jìn)一步研究證實(shí)HA/MoS2-Ti6具有一定的殺菌能力不是由防污效應(yīng)和激光誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)引起的，它的抗菌活性主要來(lái)源于其殺菌能力。

HA/ MoS2-Ti6和Ti6培養(yǎng)金黃色葡萄球菌基因表達(dá)的差異顯示上調(diào)基因主要富集于質(zhì)膜呼吸鏈復(fù)合體II、厭氧電子傳遞鏈和厭氧呼吸。其殺菌技能可能是細(xì)菌粘附在HA/ MoS2-Ti6表面時(shí)，可以有效地產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)ROS，氧化還原平衡狀態(tài)被破壞，從而起到殺菌作用。

圖3 HA/MoS2-Ti6激活細(xì)菌死亡

【HA/MoS2-Ti6從細(xì)菌中提取電子以改變代謝】

研究團(tuán)隊(duì)分析了HA/ MoS2-Ti6和Ti6兩組間基因表達(dá)的差異并觀察其細(xì)胞膜電位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌與HA/ MoS2-Ti6接觸時(shí)，其電子通過(guò)細(xì)菌-半導(dǎo)體界面的內(nèi)置電場(chǎng)移動(dòng)到HA/ MoS2-Ti6表面，從而改變了金黃色葡萄球菌的膜電位，細(xì)胞膜電位去極化是HA/MoS2涂層與細(xì)菌相互作用的結(jié)果，其代謝途徑由有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧呼吸。這些變化破壞了細(xì)菌的氧化還原平衡并誘導(dǎo)其細(xì)菌代謝途徑改變，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖4 HA/MoS2-Ti6從細(xì)菌中提取電子

【HA/MoS2-Ti6促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化】

除抗菌能力以外，研究人員還分析了HA/ MoS2-Ti6的成骨能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HA/ MoS2-Ti6改變了間充質(zhì)干細(xì)胞的膜電位，線粒體膜電位升高， Ca2+水平遠(yuǎn)高于Ti6組。當(dāng)高濃度Ca2+進(jìn)入線粒體，調(diào)節(jié)線粒體代謝，引起線粒體膜短暫去極化，這種來(lái)自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的波動(dòng)對(duì)細(xì)胞增殖發(fā)揮了重要的生理作用，細(xì)胞內(nèi)高濃度的Ca2+表明具有很強(qiáng)的成骨分化能力。

HA/ MoS2-Ti6促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖主要是由于線粒體代謝的增強(qiáng)，而不是激光熔覆引起的三維結(jié)構(gòu)。用堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定不同樣品的成骨分化能力發(fā)現(xiàn)HA -Ti6和HA/MoS2-Ti6組ALP活性均高于Ti6和MoS2-Ti6組，這與骨傳導(dǎo)性HA和HA/MoS2-Ti6可增加成骨分化能力的潛能有關(guān)，HA/MoS2-Ti6激活了Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+通路。研究還顯示了HA/ MoS2-Ti6組ALP、RUNX2和I型膠原(COL-I)表達(dá)水平較高和HA - Ti6組和HA/ MoS2-Ti6組均表現(xiàn)出高度增強(qiáng)的基質(zhì)礦化（鈣沉積），說(shuō)明HA/MoS2-Ti6有益于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

圖5 骨傳導(dǎo)HA誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和HA/MoS2異質(zhì)結(jié)的固有電位

【HA/MoS2-Ti6在體內(nèi)的骨整合】

上述結(jié)果表明HA/ MoS2-Ti6體外抗菌和成骨性能優(yōu)異，接下來(lái)進(jìn)行體內(nèi)研究。研究團(tuán)隊(duì)將假體植入雄性大鼠脛。植入后14天， HA/ MoS2-Ti6復(fù)合涂層具有最好的抗菌效果，植入后的炎癥反應(yīng)要弱得多。在植入4周后，評(píng)估了不同樣本的骨再生能力，結(jié)果表明金黃色葡萄球菌組和HA/ MoS2-Ti6不含金黃色葡萄球菌組新生骨組織比例和骨接觸情況遠(yuǎn)優(yōu)于Ti6 + S組。采用HE染色法檢測(cè)心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟等主要臟器的體內(nèi)毒性，未發(fā)現(xiàn)器官損傷跡象，說(shuō)明制備的材料沒(méi)有明顯的組織學(xué)毒理，具有良好的生物相容性。這些結(jié)果表明，合成的HA / MoS2-Ti6不僅抗菌性能，還具有良好的綜合分析，使HA /二硫化鉬制備的涂層激光熔覆是一個(gè)有效的策略來(lái)解決的兩個(gè)重大關(guān)切同時(shí)細(xì)菌感染和人工植入體骨整合。

圖6 HA/MoS2-Ti6在體內(nèi)的骨整合

【小結(jié)】

綜上所述，激光熔覆合成的HA/MoS2涂層利用間充質(zhì)干細(xì)胞和細(xì)菌之間的能量代謝差異殺滅致病細(xì)菌，同時(shí)促進(jìn)種植體的骨再生。因此，這項(xiàng)工作為設(shè)計(jì)同時(shí)具有高效抗菌活性和成骨能力的多功能骨種植體提供了一種有前景的策略，自激活抗感染種植體的發(fā)現(xiàn)有望促進(jìn)骨科種植體在臨床中的發(fā)展。