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安乃近注射液有關物質檢查

 

摘要

 

目的:

 

采用HPLC 法測定安乃近注射液的有關物質。

 

方法:

 

采用Xtimate C18( 250 mm × 4.6 mm，5 μm) 色譜柱，以磷酸鹽緩沖液( 取磷酸二氫鈉6.0 g，加水1 000 ml，加三乙胺1 ml，用氫氧化鈉溶液調pH 至7.0) -甲醇( 75:25) 為流動相，流速為1.0 ml·min-1 ; 檢測波長254 nm，柱溫為30℃; 進樣量為5 μl。

 

結果:

 

在該色譜條件下，空白輔料、雜質峰與主峰均能有效分離; 本品共檢出2 個已知雜質( 雜質C 及雜質E) 及4 個未知雜質; 

 

雜質C 的量在2.87% ~5.82% 之間，雜質E 的量均小于0.1%，4 個未知雜質量均小于0.1%。

 

結論:

 

本法簡便、準確，專屬性強，有助于更好地控制本品的質量。

 

關鍵詞

 

安乃近注射液; 高效液相色譜法; 有關物質

 

正文

 

安乃近注射液為吡唑酮類解熱止痛藥，用于高熱時的解熱，也可用于頭痛、偏頭疼、肌肉痛、關節(jié)痛和痛經等［1，2］。

 

其主要成份為安乃近，化學名稱為［( 1，5-二甲基-2-苯基-3-氧代-2，2-二氫-1-H-吡啶-4-基) 甲氨基］ 甲烷磺酸鈉鹽一水合物(C13H16N3NaO4S·H2O) ，輔料為亞硫酸鹽、依地酸二鈉、苯甲醇和注射用水等。

 

安乃近注射液現行標準收載于中國藥典2005 年版增補本［3］，國外藥典均未收載該品種?，F行標準中未控制該品種的有關物質，作為不良反應較大的高風險注射劑，有必要對有關物質開展研究。

 

本文參考相關文獻［4 ~10］，建立了HPLC 法測定該品種的有關物質，并對檢出的已知雜質的來源及毒性進行分析?，F報道如下。

 

內容由凡默谷小編查閱文獻選取，排版與編輯為原創(chuàng)。如轉載，請尊重勞動成果，注明來源于凡默谷公眾號。

 

1儀器與試藥

 

1.1 儀器

 

Agilent1260 高效液相色譜儀，包括QUAT pump VL 泵系統、ALS 進樣系統、TCC 柱溫箱及VWD 檢測器( 美國安捷倫科技有限公司) ; Dionex Ultimate3000 高效液相色譜儀，包括Ultimate3000 pump 系統、Autosampler 系統、ＲS Column Compartment及Diode Array Detector ( 美國戴安公司) ; ABS-265型電子分析天平( 瑞士梅特勒-托利多公司，分度值0.01 mg) 。

 

1.2 試藥

 

安乃近對照品( 批號: 100002-201607，按C13H16N3NaO4 S計，供HPLC 法測定，含量為94.5%) 、4-甲氨基安替比林( 雜質C) 對照品( 批號: 101115-201101，按C12H15N3O 計，含量為96.6%) 、氨基比林( 雜質D) 對照品( 批號: 100503-201302，按C13H17O 計，含量為99.9%) 、4-N-去甲基安乃近( 雜質E)對照品( 批號: 100054-201104) 均由中國食品藥品檢定研究院提供;

 

4-甲酰氨基安替比林( 雜質A) 對照品( EP，批號:4.0) 、4-氨基安替比林( 雜質B) 對照品( TＲC，批號: 1-LWJ-76-1) 、吡唑酮( 雜質F) 對照品( EP，批號: 1.0) 和安替比林( 雜質G) 對照品( 批號: 30104) 由Dr.Ehrenstorfer GmbH 提供; 甲醇( 色譜純，Burdick ＆ JacksonTM，批號: Q6CG1H) ; 

 

其余試劑均為分析純; 水為純化水。安乃近注射液15 家生產企業(yè)各1 ~3 批樣品，規(guī)格: 2 ml:0.5 g。

 

2方法與結果

 

2.1 色譜條件

 

色譜柱: Xtimate C18柱( 250 mm × 4.6 mm，5 μm) ; 流動相: 磷酸鹽緩沖液( 磷酸二氫鈉6.0 g，加水1 000 ml，加三乙胺1 ml，用氫氧化鈉溶液調pH 至7.0) -甲醇( 75:25) ; 檢測波長: 254 nm; 流速: 1.0 ml·min-1 ; 柱溫: 30℃; 進樣量: 5μl。

 

2.2 系統適用性試驗

 

取安乃近對照品及各雜質對照品適量，用無水甲醇溶解并稀釋制成10 μg·ml-1 的溶液，精密量取5 μl，按“2.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖1。

 

 

結果顯示，在該色譜條件下安乃近與其主要雜質均能有效分離。

 

2.3 強制破壞試驗

 

取樣品( N 公司，批號: 16060672) 1.0 ml，分別置50 ml量瓶中，用強光( 于照度4 500 Lx ± 500 Lx 的條件下放置5d) 、強酸( 1 mol·L-1 鹽酸溶液2 ml，室溫放置1 h，并時時振搖，加1 mol·L-1 氫氧化鈉溶液調至中性) 、強堿( 1 mol·L-1 氫氧化鈉溶液2 ml，室溫放置1 h，并時時振搖，加1 mol·L-1鹽酸溶液調至中性) 、氧化( 3% 過氧化氫溶液1 ml，室溫放置10 min，并時時振搖) 、高溫( 置70 ~80℃水浴中放置1 h，放冷) 進行破壞。

 

結果表明: 本品對酸、堿、氧化、熱、光均不穩(wěn)定，在酸、堿、氧化及熱破壞條件下，雜質C 均顯著增加，在光破壞條件下產生2 個未知雜質，所產生的降解產物在該色譜條件下能與主峰有效的分離。具體見圖2。

 

 

2.4 空白輔料干擾試驗

 

各企業(yè)的處方組成基本一致，以亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉作為抗氧劑，以依地酸二鈉作為金屬離子螯合劑，處方量略有不同; 個別企業(yè)( C 公司) 添加苯甲醇作為止痛劑。

 

稱取各企業(yè)處方中各輔料的最大取樣量制成混合空白輔料溶液，分別精密量取混合輔料溶液及空白溶劑各5 μl，依法測定，結果見圖3。

 

 

結果表明: 空白輔料在保留時間3.7 min前( 相對安乃近保留時間0.25倍處) 存在輔料峰，而C 公司的處方中的特殊輔料( 苯甲醇) 在保留時間約17.353 min( 相對安乃近保留時間1.19倍處) 存在較大的輔料峰; 輔料峰不干擾有關物質的檢測。

 

內容由凡默谷小編查閱文獻選取，排版與編輯為原創(chuàng)。如轉載，請尊重勞動成果，注明來源于凡默谷公眾號。

 

2.5 校正因子的確定

 

4-甲氨基安替比林( 雜質C) 及4-N-去甲基安乃近( 雜質E) 是樣品中檢出的主要已知雜質，對這2 個雜質相對安乃近的校正因子進行了考察。

 

分別稱取安乃近、雜質C 及雜質E 對照品，用無水甲醇溶解并稀釋制成濃度約為40，60，80，100，120，140，160 μg·ml-1 的溶液，精密量取5 #l 進樣。

 

由峰面積對溶液濃度作線性回歸，得回歸方程、相關系數、斜率和截距。用安乃近回歸方程的斜率與雜質回歸方程斜率的比值計算各雜質的校正因子。

 

結果見表1。

 

 

2.6 定量限及檢出限

 

取安乃近、雜質C 及雜質E 對照品各適量，通過逐級稀釋，進樣測定，確定安乃近、雜質C 及雜質E 的定量限( S /N≈10) 分別為0.427，0.684，0.372 μg·ml-1 ; 檢出限( S /N≈3) 分別為0.113，0.126，0.091 μg·ml-1。

 

2.7 溶液的穩(wěn)定性試驗

 

取安乃近、雜質C 及雜質E 對照品適量，分別用無水甲醇溶解并稀釋制成50 μg·ml-1 的溶液; 另取供試品( N 公司，批號: 1606067 2) 1.0 ml，用無水甲醇溶解并稀釋制成5mg·ml-1 的溶液。

 

取上述溶液分別于0，1，2，4，6，8h 取樣測定。結果顯示，安乃近、雜質C 及雜質E 對照品溶液主峰面積ＲSD 分別為0.10%、1.22% 及0.89% ( n = 6) ，3種溶液8 h 內基本穩(wěn)定; 供試品溶液中雜質C 的峰面積隨時間不斷增加，8h 內ＲSD 為23.6% ( n = 6) ，建議供試品溶液臨用新制。

 

2.8 耐用性試驗

 

取“2.2”項下系統適用性溶液，在保持其他色譜條件不變的情況下，更換儀器( Agilent 1260 和Dionex Ultimate3000) ，色譜柱品牌( Xtimate、ZOＲBAX 和InertSustain) ，調整柱溫( 30，35，40℃) 與流速( 0.9，1.0，1.1 ml·min-1 ) ，以考察測定條件有微小變動時，測定結果不受影響的程度。

 

結果表明，在改變上述色譜條件的情況下，安乃近的理論塔板數均大于5 000，與相鄰雜質峰的分離度均大于1.5，方法耐用性良好。

 

2.9 樣品測定

 

取本品適量( 約相當于安乃近250 mg) ，置50 ml 量瓶中，加無水甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液( 臨用新制) ; 

 

精密量取1 ml，置100 ml 量瓶中，加無水甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。精密量取對照溶液5 μl 注入HPLC 儀，調節(jié)檢測靈敏度，對照溶液的主峰高為滿量程的20%; 

 

再精密量取供試品溶液和對照溶液各5 μl，注入HPLC儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3.5 倍，扣除輔料峰，已知雜質采用加校正因子的自身對照法計算，未知雜質采用自身對照法計算。取15 家生產企業(yè)各1 ~3 批樣品，依法測定，結果見表2。

 

 

3討論

 

3.1 檢測波長的選擇

 

截取“2.2”項下系統適用性溶液二極管陣列檢測( DAD) 圖中安乃近與其主要中間體及雜質的紫外光譜圖，結果安乃近在263 nm 波長處有最大吸收，主要中間體及雜質的最大吸收波長各不相同，參考EP 8.0［11］，選擇254 nm作為有關物質檢測波長，在該波長下，安乃近與其主要中間體及雜質均有較大的吸收，能有效的檢出。

 

3.2 稀釋溶劑及進樣量的選擇

 

安乃近易溶于水，但在水中極易水解為雜質C，而在無水甲醇中相對較為穩(wěn)定，故選擇無水甲醇作為溶劑。

 

由于選擇無水甲醇作為溶劑，與流動相系統存在較大差異，存在較強的溶劑效應，參考EP 8.0中安乃近有關物質檢查方法［11］，將進樣量降為5 μl，獲得保留時間、理論板數、對稱性較好的色譜峰。

 

3.3 雜質的來源分析

 

本品共檢出2 個已知雜質( 雜質C 及雜質E) 及4 個未知雜質。

 

雜質E 為原料藥合成副產物，每批樣品均有檢出，雜質量均小于0.1%，符合EP 8.0 該雜質的限度要求( 0.15%) 。

 

雜質C 既是安乃近合成中間體，也是水解產物，同時也是活性代謝物，每批樣品均有檢出，雜質量在2.87 ～5.82%之間，參照安乃近原料藥現行標準雜質C 限度( 0.5%) 及安乃近片現行標準［10］雜質C 限度( 1.0% ) 擬訂本品的雜質C 限度為1.0%，38 批樣品均不符合規(guī)定。已知雜質C 及E 的結構見圖4。

 

 

3.4 雜質的毒性分析

 

通過美國Simulations Plus 公司的ADME/T 性質預測軟件ADMET PredictorTM ( Version 8.1.0.11，Simulations Plus，Inc.，USA) ，對安乃近及已知雜質的毒理做全面預測: 三者的整體毒性風險打分均小于3.3( 該風險系數越大，表示化合物的毒性性質越不理想，建議毒性風險≤3.3) ，風險較低; 但三者毒性存在差異，安乃近和雜質E 未表現出明顯毒性; 雜質C 表現出小鼠致癌性和一定的致突變性，整體毒性比較雜質C ＞ 雜質E≈安乃近。