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嘉峪檢測網(wǎng) 2021-12-06 23:50
前 言
生物樣品的穩(wěn)定性考察往往根據(jù)具體樣品采集的情況，對生物樣品在室溫、冰凍或凍融、不同存放時(shí)間進(jìn)行穩(wěn)定性考察，同時(shí)還需注意儲備液的穩(wěn)定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性，以最大程度保證樣品測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
穩(wěn)定性研究的意義
生物樣品穩(wěn)定性研究常常是所有分析研究人員日常熱議的話題之一。如在國際生物分析論壇上其也是受到廣大研究人員的青睞。表1所示是第二屆國際生物分析論壇擬討論主題投票結(jié)果。其中，前五項(xiàng)得票最高的有三項(xiàng)與生物樣品穩(wěn)定性直接相關(guān)，說明生物樣品穩(wěn)定性研究的重要性，因?yàn)楸ＷC樣品在生物基質(zhì)中的穩(wěn)定性是生物樣品分析的基本前提。
表1 第二屆國際生物分析論壇討論主題調(diào)查結(jié)果
基于此，各國藥監(jiān)部門均建議對實(shí)際研究樣品進(jìn)行再分析。主要是因?yàn)榕渲频男Ｕ龢?biāo)樣和真實(shí)研究樣品之間存在差別，這種差別是由于真實(shí)樣品經(jīng)歷了體內(nèi)循環(huán)及代謝轉(zhuǎn)化途徑。導(dǎo)致再分析失敗的主要原因是分析物在基質(zhì)中不穩(wěn)定，及其樣品中不穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物和生物樣品中的相關(guān)基質(zhì)組分。如圖1所示，比較了文獻(xiàn)報(bào)道案例中已測樣品再分析（ISR）失敗的各種原因所占的比例。
圖1 文獻(xiàn)報(bào)道的案例中ISR失敗的各種原因
現(xiàn)在對ISR和已測樣品穩(wěn)定性（ISS）的研究已成為生物分析中不可缺少的一部分，是一種評估方法重現(xiàn)性的重要指標(biāo)。ISR是通過選擇部分樣品進(jìn)行重新分析，所測值與最初測試結(jié)果比對，從而證實(shí)方法的可信度。ISS是監(jiān)測分析物和代謝產(chǎn)物在儲存期間穩(wěn)定性的方式，足見穩(wěn)定性研究的重要性。
穩(wěn)定性研究的主要內(nèi)容
盡管FDA指導(dǎo)原則（2018年05月發(fā)布）中包含6個(gè)方面（自動進(jìn)樣器中穩(wěn)定性、室溫穩(wěn)定性、樣品處理后溶液穩(wěn)定、凍融穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性和儲備液或工作液穩(wěn)定性），但從指導(dǎo)原則中我們可以理解樣品穩(wěn)定性包含了5個(gè)方面，并不是所有的穩(wěn)定性項(xiàng)目我們必須考擦，在申報(bào)資料中常常只對其中的2～3項(xiàng)進(jìn)行考察。中國藥典（2015版）中提及穩(wěn)定性檢查應(yīng)考察不同儲存條件，時(shí)間尺度應(yīng)不小于試驗(yàn)樣品儲存時(shí)間。通常應(yīng)該進(jìn)行分析物和內(nèi)標(biāo)的儲備液和工作液的穩(wěn)定性、從冰箱儲存條件到室溫或樣品處理溫度、基質(zhì)中分析物的冷凍和融化穩(wěn)定性以及基質(zhì)中分析物在冰箱儲存的長期穩(wěn)定性考察。此外，如果適用，也應(yīng)該進(jìn)行處理過的樣品在室溫下和試驗(yàn)過程儲存條件下的穩(wěn)定性以及處理過的樣品在自動進(jìn)樣器溫度下的穩(wěn)定性考察。
1、冰凍穩(wěn)定性（冷凍穩(wěn)定性或長期穩(wěn)定性）
配制好數(shù)份低、中、高含藥生物樣品后冰凍，分別在數(shù)天或數(shù)十天時(shí)，取出化凍測定血藥濃度，計(jì)算回收率來考察穩(wěn)定性。冷凍穩(wěn)定性（常規(guī)為－20°C）的目的是考察樣品貯存的低溫極限條件。因此所有樣品分析必須滿足一定時(shí)間內(nèi)在特定的貯存溫度下的穩(wěn)定性要求。如有些樣品凍存僅一周穩(wěn)定，不能滿足樣品分析周期要求，可采用合適的方式延長冷凍穩(wěn)定性，如采用超低溫冰箱保存降低冰凍溫度，也可采用加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如含巰基化合物，添加抗氧化劑維生素C能大大延長冷凍穩(wěn)定性。
2、樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性（測定溶液的穩(wěn)定性）
含藥生物樣品于配制好后按“血漿樣品的處理”項(xiàng)立即處理，置室溫中分別在數(shù)小時(shí)或數(shù)十小時(shí)時(shí)測定，常將測定溶液放置在低溫進(jìn)樣器中考察。該實(shí)驗(yàn)的目的是考察在樣品量大、分析批內(nèi)待機(jī)時(shí)間長所致的待測樣品發(fā)生的變化或儀器污染/疲勞/基線漂移等所造成的系統(tǒng)偏差。
HPLC法中如采用UV或FLD檢測，可采用統(tǒng)計(jì)樣品主峰面積RSD%考察。生物樣本污染較大，當(dāng)采用MS或MS/MS檢測時(shí)，連續(xù)進(jìn)樣易污染加熱毛細(xì)管，導(dǎo)致主峰面積逐漸下降，此時(shí)需要同時(shí)跟蹤線性測定進(jìn)行考察。也可考察降解雜質(zhì)的變化來判斷，如含奧美拉唑生物樣品通過考察主要降解雜質(zhì)磺?；铮@種方法有時(shí)更為準(zhǔn)確。
3、凍融穩(wěn)定性
配制好低、中、高含藥生物樣品，凍融數(shù)次（常3次），測定血藥濃度，計(jì)算回收率來考察穩(wěn)定性。FDA指導(dǎo)原則中規(guī)定采用QC樣品進(jìn)行凍融穩(wěn)定性考察，凍融次數(shù)至少為3次以上且每次樣品凍存時(shí)間至少12 h以上，然后再進(jìn)行后續(xù)循環(huán)步驟。
由于生物樣品分析復(fù)雜、誤差大，易產(chǎn)生可疑數(shù)據(jù)，往往需要重新測定來確定數(shù)據(jù)的可信度，該穩(wěn)定性為上述測定提供保證。如含賴諾普利血樣，冷凍放置7天內(nèi)基本穩(wěn)定，凍融兩次賴諾普利降解50％以上。解決凍融不穩(wěn)定性的辦法有：血樣采集分離后，立即定量分成多份冷凍方式，以滿足實(shí)驗(yàn)要求。
4、室溫穩(wěn)定性
配制好低、中、高含藥生物樣品后，在室溫條件下放置數(shù)小時(shí)至數(shù)十小時(shí)后，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)立即處理測定，計(jì)算回收率來考察穩(wěn)定性。該實(shí)驗(yàn)?zāi)康目疾煅獫{樣品處理過程中，待處理樣品放置的合適條件。如文獻(xiàn)報(bào)道，含尼莫地平血樣在室溫穩(wěn)定性較差，需要凍融后立即處理測定，但這種情況會影響測定的效率，經(jīng)室溫穩(wěn)定性考察后發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)格避光條件下，血樣在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
5、儲備液的穩(wěn)定性
對照品儲備液分別置冰箱中（4℃）放置數(shù)天數(shù)十天后，取出后直接測定，測定方法可不同于含藥生物樣品的測定。如僅放置幾天，可采用測定條件連續(xù)測定，計(jì)算樣品主峰面積的RSD%來考察；如對照品容易獲得，可采用新配制對照品溶液外標(biāo)法計(jì)算儲備液的含量來考察；對于昂貴的對照品（如代謝物）可采用HPLC歸一化法聯(lián)合吸收系數(shù)法來考察待測成分的變化。
最后需要強(qiáng)調(diào)的是，由于樣品千差萬別，理化性質(zhì)各有不同，為保證測定的準(zhǔn)確性，還需要視化合物不同開展其他的穩(wěn)定性考察，如光解效應(yīng)、氧化效應(yīng)、吸附效應(yīng)。
穩(wěn)定性的評估
1、全血穩(wěn)定性評估目的
評估藥物在全血中穩(wěn)定性的科學(xué)理由是為了給動物或臨床中心提供相關(guān)指導(dǎo)，以確保藥物在整個(gè)采集過程中穩(wěn)定。藥物全血穩(wěn)定性評估應(yīng)該在要驗(yàn)證的方法所使用的種屬基質(zhì)中進(jìn)行。但是在實(shí)驗(yàn)之前，建議查詢現(xiàn)有的關(guān)于該目標(biāo)藥物全血穩(wěn)定性文獻(xiàn)，此外也可以參考該藥物在生產(chǎn)控制開發(fā)階段已經(jīng)建立的化學(xué)穩(wěn)定性及其它結(jié)構(gòu)類似化合物包括已知雜質(zhì)的穩(wěn)定性。
實(shí)例：如表2所示，曲普瑞林在大鼠全血中穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示曲普瑞林在大鼠全血中不穩(wěn)定，室溫條件下0.5 h已經(jīng)有接近30%的曲普瑞林被降解或轉(zhuǎn)化，濕冰上放置2 h后也不穩(wěn)定。然而，有數(shù)據(jù)表明曲普瑞林在大鼠血漿中室溫放置6 h是穩(wěn)定的。對于睪酮而言，其在全血和血漿條件下均為穩(wěn)定。
表2 曲普瑞林和睪酮在大鼠全血中穩(wěn)定性結(jié)果
故穩(wěn)定性考察應(yīng)該能覆蓋所有全血樣品采集和血漿、血清樣品產(chǎn)生的步驟。這包括如何從受試者或動物采集全血樣品（如有必要）及冷凍儲存和運(yùn)輸前的血漿、血清制備步驟。
2、影響藥物全血穩(wěn)定性的因素
一些環(huán)境和化學(xué)因素能影響藥物在全血里的穩(wěn)定性。常見的化學(xué)和環(huán)境方面的因素有：取樣基質(zhì)的天然pH或加入一些抗凝劑后改變pH影響藥物的穩(wěn)定性；光氧化影響藥物的穩(wěn)定性。另外，全血中含有的具清除氧氣屬性的血紅蛋白有光氧化穩(wěn)定化效果，故和血漿樣品相比，全血更不容易有光氧化穩(wěn)定性問題。
在某種程度上，這些化學(xué)和環(huán)境方面的因素比較容易控制。但是，生物因素會對藥物在基質(zhì)里的不穩(wěn)定性有顯著的影響。例如，存在于紅細(xì)胞和血漿中的有些酶能影響到藥物的穩(wěn)定性。
3、從全血獲得血漿的穩(wěn)定性的評估方法
如果用血漿作為分析基質(zhì)，用來做穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的含有分析物的全血樣品需要被處理成血漿并用在后續(xù)的分析里。衍生血漿的方式依靠測定藥物在血漿（時(shí)間零點(diǎn)）中的初始濃度，穩(wěn)定性是比較它與后續(xù)測定得到的數(shù)值。在這種實(shí)驗(yàn)中，全血要在最開始就加入藥物。在測定零點(diǎn)時(shí)間值前，分析物必須要在血液成分中平衡，因此藥物在血漿中的標(biāo)示濃度是未知的。雖然看起來與業(yè)界指導(dǎo)及規(guī)范闡述的一般的穩(wěn)定性途徑相違背，但這種做法還是被廣泛接受，因?yàn)樗３至俗銐虻目茖W(xué)性。
一般來說，穩(wěn)定性評估會選擇多個(gè)時(shí)間點(diǎn)（如0h,1h,2h,4h,6h）測量衍生的血漿樣品。測試的樣品會儲存在室溫條件下以代表采血中心的條件。時(shí)間零點(diǎn)的全血樣品的血漿部分會在全血和血漿分離完成后得到，放置的全血的血漿會在預(yù)定時(shí)間制取。血漿樣品會-20°C儲存（如果凍融和冷凍穩(wěn)定性已經(jīng)建立），所有樣品會在一個(gè)分析批里完成用以防止批間差異，并且和校正標(biāo)樣、6個(gè)QC樣品一起分析。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)與零時(shí)間點(diǎn)測定的藥物濃度作比較，接受標(biāo)準(zhǔn)是常規(guī)的±15%。另外的選擇是簡單地比較每個(gè)時(shí)間點(diǎn)與零時(shí)間點(diǎn)測定的檢測器響應(yīng)值（峰面積或使用內(nèi)標(biāo)時(shí)為峰面積比），接受標(biāo)準(zhǔn)是±15%，這種做法的優(yōu)點(diǎn)是不用使用校正曲線。
該方法評估全血穩(wěn)定性的主要確定是這種方法主要依賴零時(shí)間點(diǎn)樣品。因?yàn)楫?dāng)藥物加入到全血樣品中后，藥物分配到全血，不同組分達(dá)到平衡的時(shí)間是未知的。一般這個(gè)現(xiàn)象的動力學(xué)一般是很快的，但是有文獻(xiàn)報(bào)道某些化合物達(dá)到分配平衡需要很長時(shí)間。故零時(shí)間點(diǎn)也只能是隨機(jī)設(shè)定。達(dá)到分配平衡前設(shè)定的零時(shí)間點(diǎn)可能會導(dǎo)致失敗和短的穩(wěn)定性周期。
4、全血的穩(wěn)定性的評估方法
如果選擇全血作為分析基質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性考察，上面提及的平衡分配的現(xiàn)象就不是一個(gè)主要的問題。用全血基質(zhì)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)被認(rèn)為是黃金標(biāo)準(zhǔn)方案，但這會導(dǎo)致問題復(fù)雜，因?yàn)檠獫{或血清的方法可能不適于分析全血樣品。
在這種情況下，可以使用簡單的不包括在方法驗(yàn)證程序里的但專為全血穩(wěn)定性評估使用的蛋白沉淀方法。用這種方式，全血穩(wěn)定性樣品可以通過延用一個(gè)認(rèn)證的方法并結(jié)合在全血中準(zhǔn)備的校正標(biāo)樣和QC樣品進(jìn)行評估，并用常規(guī)的接受標(biāo)準(zhǔn)來定量。但是，直接簡單地比較零時(shí)間點(diǎn)和在指定存放周期后的樣品響應(yīng)值偏差范圍可能會更直接。如果響應(yīng)值偏差在±15%內(nèi)，穩(wěn)定性就可以確定。
此外，采用真實(shí)樣品來做全血穩(wěn)定性評估。這種方式不需要假設(shè)加入分析物的全血樣品，類同于從受試者采到全血樣品，也不需要知道平衡時(shí)間。實(shí)際上，這是最好的用于測定試驗(yàn)樣品穩(wěn)定性的方法，但因?yàn)樗幬镌谌械某跏紳舛仁俏粗?，可能不會被法?guī)部門接受。
5、穩(wěn)定性研究一般評估方法及統(tǒng)計(jì)方法
中國藥典（2015版）中規(guī)定：采用低和高濃度質(zhì)控樣品（空白基質(zhì)加入分析物至定量下限3倍以內(nèi)以及接近定量上限），在預(yù)處理后以及在所評價(jià)的條件儲存后立即分析。由新鮮配制的校正標(biāo)樣獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析質(zhì)控樣品，將測得濃度與指示濃度相比較，每一濃度的均值與表示濃度的偏差應(yīng)在±15%范圍內(nèi)，但未明確指出平行樣品個(gè)數(shù)。不過，在生物分析穩(wěn)定性評估的接受標(biāo)準(zhǔn)是熟悉的4-6-15規(guī)則。也就是說，在一系列的6個(gè)重復(fù)穩(wěn)定性樣品中至少4個(gè)樣品的結(jié)果必須落在理論值或零時(shí)間點(diǎn)值的15%內(nèi)。
穩(wěn)定性影響因素及控制策略
1、物理因素
（1）光敏性
光化學(xué)不穩(wěn)定性藥物常見于含有不飽和碳碳雙鍵分子（如可能會發(fā)生E/Z異構(gòu)化的鏈烯烴）和（或）含有雜環(huán)雙鍵，如羰基、硝基芳香族基團(tuán)和芳基氯化物基團(tuán)（其中可能發(fā)生脫氯反應(yīng)）的分子。
對于光敏感的樣品，在樣品采集時(shí)可采用棕色樣品采集管，或者在采集管外包裹錫箔，在只能透過特定波長（如濾過黃色光）的燈光下進(jìn)行操作，以及將樣品儲存在避光箱內(nèi)。如果化合物對光及其敏感，可以使用光度計(jì)測定保持樣品穩(wěn)定的最大光強(qiáng)度。
例如，洛美沙星光化學(xué)降解反應(yīng)產(chǎn)生兩個(gè)主要的降解產(chǎn)物。
（2）熱不穩(wěn)定
升高溫度會加速化合物在指定基質(zhì)中的降解速率或者導(dǎo)致一些不良的化學(xué)反應(yīng)。對于此類藥物，最好的辦法是將全血樣品采集后立即冷凍保存（如果生物基質(zhì)是全血），或立即將全血樣品進(jìn)行處理，如在4°C及以下溫度離心獲得血漿樣品后迅速放入-80°C冰箱保存。
（3）酸堿度不穩(wěn)定
由于某些化學(xué)反應(yīng)需要在特定的pH條件下才能被催化，某些酶只能在特定的pH范圍內(nèi)才能起作用，因此對于對化學(xué)及酶不穩(wěn)定的化合物，控制pH非常重要。典型的受pH影響的不穩(wěn)定化合物包括易形成?；咸烟侨┧岬拇x產(chǎn)物、酯類、酰胺類、內(nèi)酯類、內(nèi)酰胺類的酸性化合物。比如他汀類藥物轉(zhuǎn)化（內(nèi)酯環(huán)水解）為β羥基他汀酸。在較高pH環(huán)境如生理pH下，這種轉(zhuǎn)化會增強(qiáng)，嚴(yán)格控制pH在4.5，并且在低溫環(huán)境下能減少這種轉(zhuǎn)化。
例如，喜樹堿在不同pH條件下其內(nèi)酯和羧酸鹽形式之間的互相轉(zhuǎn)變。
（4）酶催化導(dǎo)致不穩(wěn)定
在確定樣品不穩(wěn)定是由于酶的作用前，首先應(yīng)該排除不穩(wěn)定不是因?yàn)榛衔锼庠斐傻?，否者即使添加酶抑制劑也不能起到穩(wěn)定化合物的作用。并在選擇酶抑制劑時(shí)應(yīng)優(yōu)選考慮低毒性的物質(zhì)。
通常會在樣品采集管里添加氟化鈉用來測定葡萄糖含量，它能夠抑制葡萄糖代謝，并且是一種蛋白質(zhì)變性劑。另一種阻止因?yàn)槊缸饔檬够衔锊环€(wěn)定的方法是直接將樣品采集到有機(jī)溶劑中，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑能使蛋白質(zhì)和酶變性。
酯酶是導(dǎo)致化合物不穩(wěn)定的最普遍的酶。酯酶又可以分為膽堿酯酶、羧酸酯酶、絲氨酸酯酶和芳基酯酶。這些酶在全血、血漿、血清及生物組織（如肝臟）等生物基質(zhì)里有不同的含量。這些酶在嚙齒類動物中大量存在，但是在人體中含量較少。人血中只含有丁酰膽堿酯酶、乙酰膽堿酯酶、白蛋白酯酶和對氧磷酶這四種酯酶。表3列舉了一些全血和血漿中常見酶的種類及它們的酶抑制劑和需要添加這些酶抑制劑的化合物。另外值得注意的是，所有用到的空白基質(zhì)都應(yīng)該加入與樣品中添加量相等的酶抑制劑。
表3 常見酶的類別及對應(yīng)的酶抑制劑舉例
（5）化學(xué)因素
1）由于氧化原因?qū)е碌牟环€(wěn)定
這種不穩(wěn)定通常存在于含有苯基或羥基的化合物中。最常用的抗氧化劑是維生素C，另一種廣泛用來穩(wěn)定親脂性化合物如維生素A、維生素E的抗氧化劑是BHT，該抗氧化及的濃度依據(jù)稀釋劑的種類有所不同。
例如，硝苯地平光化學(xué)降解后的氧化反應(yīng)。
另一類容易被氧化的化合物是硫醇類化合物。硫醇類化合物可形成二聚體，或在分子內(nèi)形成二硫鍵，如半胱氨酸等含硫基團(tuán)的化合物。為了穩(wěn)定這類分子，可以選擇在樣品采集時(shí)將其衍生化。甲基丙烯酸酯是一個(gè)好的衍生化試劑，且經(jīng)其衍生化后的化合物并不產(chǎn)生新的手性中心。
2）N-氧化物相互轉(zhuǎn)化
N-氧化物是眾所周知的在生物樣品中不穩(wěn)定的一類代謝產(chǎn)物。這類化合物通常在還未從全血中制備成血漿時(shí)就已經(jīng)不穩(wěn)定了。同時(shí)，在樣品中加入某些穩(wěn)定原藥的試劑（如維生素C）也有可能導(dǎo)致N-氧化物發(fā)生還原反應(yīng)。因此，在分析此類化合物時(shí)，無論在樣品采集階段還是樣品分析處理階段都應(yīng)該十分小心。
3）手性化合物相互轉(zhuǎn)化
所有的手性化合物在特定的條件下都會相互轉(zhuǎn)化，但是通常只有在生理pH或正常生物體溫下的轉(zhuǎn)化才會對生物分析造成一定的影響。一般情況下，可以選擇加入緩沖試劑改變其pH，或?qū)悠穬Υ嬖?80°C下。
小分子化合物在生物基質(zhì)中穩(wěn)定性控制策略及示例
1、穩(wěn)定性控制策略
如圖2所示，為小分子化合物在生物基質(zhì)中穩(wěn)定性控制策略流程圖，基于待分析化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并按照該流程思路進(jìn)行排查，能便于解決基質(zhì)中不穩(wěn)定化合物問題。值得指出的是，穩(wěn)定性研究也遵循case by case的原則，也就是根據(jù)生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及基質(zhì)類型等對穩(wěn)定性的影響。
圖2 小分子化合物在生物基質(zhì)中穩(wěn)定性控制策略流程圖
2、穩(wěn)定性控制舉例
（1）氯吡格雷代謝物
（2）谷胱甘肽、半胱氨酸和同型半胱氨酸
（3）霉酚酸?；咸擒账?/span>
（4）咖啡酸類及其氟化衍生物
（5）辛伐他汀及辛伐他汀酸
（6）萘莫司他
（7）吉西他濱
小結(jié)
綜上所述，不難判斷出生物樣品穩(wěn)定性對于保證樣品分析結(jié)果準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性具有的重要意義，同時(shí)其也是生物分析方法學(xué)驗(yàn)證中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，需要我們較為細(xì)致的研究?？赡婧筒豢赡娣磻?yīng)都能在生物基質(zhì)分析中遇到并能影響原型藥物和藥物代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性。溫度、光照、pH、氧化和酶解反應(yīng)是樣品在基質(zhì)中穩(wěn)定性最為常見的影響因素。除此之外，手性化合物和氘代內(nèi)標(biāo)可能會因其它影響因素而發(fā)生降解，故在進(jìn)行穩(wěn)定性研究過程中也要予以考慮。最后，本文限于筆者水平，如有不足之處，請大家多多指教，望能趁此機(jī)會和大家一起交流和學(xué)習(xí)。
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來源：Internet
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