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在進(jìn)行藥物的有關(guān)物質(zhì)檢查時，多采用高效液相色譜法，其計算方法有外標(biāo)法、加校正因子的自身對照法、自身對照法及峰面積歸一化法。其中加校正因子的自身對照法定量準(zhǔn)確，又無需在每次檢測時均提供雜質(zhì)對照品，是目前較為常用的一種方法。小編在此對校正因子的測定以及校正因子準(zhǔn)確度的驗證進(jìn)行簡述。

一、校正因子的測定

校正因子的測定有單點法、多點法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法及吸收系數(shù)比值法。已有多篇文獻(xiàn)報道過各方法的基本操作及優(yōu)缺點，在此不再贅述。在進(jìn)行校正因子測定時，小編建議采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，因為線性試驗是方法驗證必不可少的一項內(nèi)容，在此采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，既驗證了雜質(zhì)對照品及主成分的線性，又可得到準(zhǔn)確的校正因子，可謂一舉兩得。

在進(jìn)行校正因子的測定時，首先將各雜質(zhì)對照品及主成分對照品配制成一定濃度的儲備液，逐步稀釋，直至找到各雜質(zhì)的定量限，線性范圍應(yīng)包括定量限濃度~限度濃度的150%，主成分的濃度范圍應(yīng)包括定量限濃度~自身對照濃度的150%。例如，有關(guān)物質(zhì)測定時，供試品的濃度為1mg/ml，采用0.1%的自身對照（即自身對照的濃度為1μg/ml），雜質(zhì)A的限度為0.1%（即雜質(zhì)A的限度濃度為1μg/ml），假設(shè)主成分及雜質(zhì)A的定量限均為20ng/ml，則雜質(zhì)A和主成分應(yīng)在20ng/ml~1.5μg/ml的范圍將濃度與峰面積進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.990，Y軸截距應(yīng)在100%響應(yīng)值的25%以內(nèi)。繪制出各雜質(zhì)及主成分的線性曲線后，各雜質(zhì)與主成分線性方程斜率的比值即為該雜質(zhì)的校正因子。若雜質(zhì)的校正因子在0.9~1.1的范圍內(nèi)，無需驗證，直接采用自身對照法，若雜質(zhì)的校正因子0.2~5.0之間，則需要采用加校正因子的自身對照法，若雜質(zhì)的校正因子小于0.2或大于5.0，可考慮變換雜質(zhì)的檢測波長，重新進(jìn)行測定，若所有的測定均在0.2~5.0之外，則表示加校正因子的自身的對照法不適用，需要用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

在配制各濃度的線性溶液時，一定注意需逐級稀釋，要避免出現(xiàn)下圖1所示的情況，應(yīng)如圖2所示，保證個點分布的均勻性。

圖1  不正確的線性試驗設(shè)計

圖2 正確的線性試驗設(shè)計

二、相對校正因子及相對保留時間耐用性的考察

在采用加校正因子的自身對照法進(jìn)行定量時，一般采用相對保留時間對雜質(zhì)進(jìn)行定位，在此，一并對相對校正因子及相對保留時間的耐用性進(jìn)行考察。

具體考察方法同其他方法驗證的耐用性試驗，即變換波長、流速、柱溫、流動相比例、流動相pH值、采用不同品牌的色譜柱、儀器等。將各雜質(zhì)對照品與主成分配制成混合對照品溶液，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，繪制各條件下雜質(zhì)對照品及主成分對照品的線性方程，計算校正因子，同時計算出各條件下雜質(zhì)對照品相對于主成分的相對保留時間。

對相對校正因子，除波長的變化會對相對校正因子有所影響外，其余色譜條件的調(diào)整均不會對相對校正因子產(chǎn)生影響，因此，測定波長的選擇要避開吸光度急劇變化的位置，應(yīng)選擇在最大吸收或最小吸收的位置。校正因子的變化范圍在多少范圍內(nèi)可以接受，目前，沒有定論，小編認(rèn)為，如果最終標(biāo)準(zhǔn)中相對校正因子只保留到小數(shù)點后一位，例如0.7，則各條件下校正因子均控制在0.65~0.74范圍內(nèi)，即可判定耐用性較好。即采用有效數(shù)字的修約規(guī)則，修約后為標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的數(shù)值即可。

對相對保留時間，除波長的變化對其沒有影響外，其余各條件的變化均會對其產(chǎn)生影響，為了保證對雜質(zhì)的準(zhǔn)確定位，必須對相對保留時間的耐用性進(jìn)行考察。此處的試驗不是為了證明相對保留時間的耐用性良好，而是通過耐用性考察確定出如何采用相對保留時間對雜質(zhì)進(jìn)行定位。例如，固定色譜柱的填料及品牌，固定主峰的保留時間等。至于RRT在多少范圍內(nèi)可以接受，不能一概而論，若雜質(zhì)譜較復(fù)雜，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的RRT需要保留至小數(shù)點后兩位，如果雜質(zhì)譜相對簡單，各雜質(zhì)距離較遠(yuǎn)，RRT保留至小數(shù)點后一位即可。在此，跟大家分享另外一個經(jīng)驗，即如果某些雜質(zhì)的相對保留時間無法固定，隨色譜參數(shù)的變化較明顯，則可以采用將主成分進(jìn)行定向破壞，通過系統(tǒng)適用性試驗來對雜質(zhì)進(jìn)行定位。

三、相對校正因子準(zhǔn)確度的考察

配制相同的供試品溶液，同時采用加校正因子的自身對照法及外標(biāo)法，對供試品中的雜質(zhì)含量進(jìn)行測定，對兩種方法的測定結(jié)果進(jìn)行比較，校正因子與外標(biāo)法計算結(jié)果的負(fù)偏差不得過0.05%，正偏差不做規(guī)定。若供試品中檢出的雜質(zhì)較少，可在供試品中加入一定量的雜質(zhì)對照品，來進(jìn)行測定。

至此，可將相對校正因子固化到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，采用加校正因子的自身對照法對已知雜質(zhì)進(jìn)行定量計算，既保證了定量結(jié)果的準(zhǔn)確，又簡化了試驗，節(jié)省了對照品的用量。