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01抗體偶聯(lián)藥物

 

抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC），這個概念最早在100 年前便由德國醫(yī)生和科學(xué)家保羅·埃利希（Paul Ehrlich）提出。ADC是一種將小分子細(xì)胞毒素藥物（cytotoxin）通過連接子（linker）與單克隆抗體偶聯(lián)形成的藥物，既有抗體的高靶向性又可以有化學(xué)藥物的強殺傷力，因此也被稱之為“生物導(dǎo)彈”。隨著單克隆抗體藥物的蓬勃發(fā)展，這種新型抗癌藥物慢慢進入人們的視野并逐漸成為今天的發(fā)展熱點。自2000年，第一個ADC 藥物MylotargR用于治療CD33陽性急性髓系白血病被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)以來，全球共有12個ADC獲批上市，其中包括今年由中國本土公司榮昌生物研發(fā)并在中國上市的愛地希（Disitamab gedovin）[1]。在過去十年，ADC研發(fā)的速度顯著加快，至今有80多個正在臨床試驗中[2]- [5]。

 

 

圖一 ADC結(jié)構(gòu)

 

02 抗體偶聯(lián)藥物的作用機制

 

正常狀態(tài)下，ADC藥物進入體內(nèi)后，抗體部分與表達腫瘤抗原的靶細(xì)胞特異性結(jié)合，通過內(nèi)吞作用內(nèi)化進入細(xì)胞，經(jīng)過內(nèi)吞小體進入溶酶體，溶酶體的酸性環(huán)境和一些蛋白水解酶會致ADC降解，小分子細(xì)胞毒在胞內(nèi)以高效活性形式被釋放隨后進入細(xì)胞質(zhì)，從而破壞DNA或通過抑制微管合成等方式，完成對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，見圖二[6]。因此，與傳統(tǒng)的小分子化學(xué)藥物以及抗腫瘤單抗相比，ADC藥物不僅可以提高化學(xué)治療的療效和腫瘤細(xì)胞的特異性，而且可以降低或者減弱系統(tǒng)毒性以及非靶向性細(xì)胞毒性，但由于ADC自身所具有的特殊結(jié)構(gòu)和復(fù)雜多樣性，使得在臨床前的藥代動力學(xué)研究、安全性評價以及臨床階段，其分析方法的復(fù)雜性就變得異常重要。主要原因是由于隨著ADC進入體內(nèi)后，其連接的小分子毒素會逐漸解離下來會形成多樣化且可能動態(tài)變化的DAR值（藥物-抗體比，drug-to-drug ratio）分布，同時還有可能出現(xiàn)與小分子毒素相關(guān)的代謝產(chǎn)物，而DAR值是重要的藥效和毒性評價指標(biāo)。針對這個過程中不同類型的分析物，我們需要根據(jù)實驗需要選擇不同的分析平臺來完成檢測目的。

 

 

圖二 ADC藥物作用機制

 

03抗體偶聯(lián)藥物的分析策略

 

根據(jù)ADC的作用機制，ADC在體內(nèi)會產(chǎn)生多種成分，主要包括完整的ADC、總抗體（DAR大于等于0）、游離的小分子毒素以及毒素相關(guān)的代謝產(chǎn)物。而由于進入體內(nèi)這個動態(tài)變化的過程以及ADC獨特的結(jié)構(gòu)特征，會進一步增加誘發(fā)機體的免疫反應(yīng)而形成抗藥抗體的風(fēng)險，不僅因為單抗可以作為抗原引發(fā)免疫反應(yīng)，連接子或連接子-細(xì)胞毒素也可以作為半抗原引發(fā)免疫反應(yīng)[7]。目前，對于ADC、總抗以及抗藥抗體多采用LBA平臺，對于小分子毒素以及相關(guān)的則主要是LC-MS/MS平臺；而對于研究者們，在研究ADC藥物理化性質(zhì)方面，DAR則其重要的研究對象，一般可以采用光譜測定法[8]、色譜-紫外測定法[9]、質(zhì)譜法等進行[10]。

 

3.1 ADC的測定

 

3.1.1 LBA平臺ADC的測定

 

對于ADC濃度的測定，多采用LBA (Ligand Binding Assay)平臺的ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法）進行檢測。對于ELISA方法，通常固相載體表面包被捕獲試劑，如靶點抗原、互補決定區(qū)（complementarity determining region, CDR）單克隆抗體等，通過抗毒素抗體檢測。對于ECL方法，原理和ELISA類似，目前主要由基于MSD (Meso Scale Discovery) 公司的開發(fā)的超敏多因子電化學(xué)發(fā)光分析儀，其較ELISA通常具有更高的靈敏度和更寬的檢測范圍。但并非儀器決定了方法的靈敏度，LBA平臺的靈敏度和準(zhǔn)確度主要取決于所用試劑的親和力大小以及ADC藥物本身的載藥量。

 

針對目前火熱的ADC靶點如Her2、Trop-2、Claudin 18.2等，藥明康德生物分析部大分子團隊均有針對相關(guān)靶點成功開發(fā)方法的經(jīng)驗，并已賦能多個客戶的方法學(xué)驗證和臨床前安全性評價及臨床試驗的樣本分析。

 

3.1.2 LC-MS/MS平臺ADC的測定

 

隨著LC-MS/MS分析技術(shù)的廣泛應(yīng)用，免疫親和捕獲LC-MS/MS開始用于抗體的測定。通常分為三個步驟[11]，第一步是免疫捕獲，相當(dāng)于傳統(tǒng) LBA平臺的第一步，第二步是酶切或消化，最后一步是 LC 分離和 MS/MS 檢測。與 LBA平臺一樣，可以使用各種特異性捕獲試劑，包括靶抗原、抗Id 抗體或抗有效載荷抗體。同時Protein A/G 也可作為通用捕獲試劑，因為可以結(jié)合IgG Fc段。然后將其生物素化抗體可固定在鏈霉親和素包被的磁珠或小柱上。在隨機偶聯(lián) ADC 的情況下，可以使用組織蛋白酶-B 進行酶消化來釋放有效負(fù)載的小分子毒素，或通過胰蛋白酶消化以生成特征肽段[12]，然后通過 LC–MS/MS定量檢測。

 

 

圖三 LB-LC-MS/MS步驟

 

（A. 免疫捕獲；B. 酶切或消化；C. LC-MS/MS定量）

 

目前藥明康德生物分析團隊已基于LC-MS/MS平臺建立通用性和特異性的ADC分析方法，檢測下限低至50 ng/mL，已賦能多個ADC的檢測。

 

3.2 總抗的測定

 

3.2.1 LBA平臺總抗體的測定

 

總抗體是指DAR≥0的抗體，用于評估ADC藥物是否具備單克隆抗體一般PK特性。對于總抗體檢測，通常采用包被靶點抗原或抗CDR區(qū)單克隆抗體的方式進行捕獲，再根據(jù)抗體的種屬性，用酶標(biāo)的抗同種屬IgG作為檢測抗體。這種傳統(tǒng)的ELISA方法，技術(shù)較成熟，因此應(yīng)用范圍較廣。而對于專屬性試劑難以獲取時，尤其時前期候選藥物篩選階段，可以考慮通用型分析方法，即捕獲試劑和檢測試劑均為抗人IgG抗體，這種分析模式從成本和時間角度更具優(yōu)勢，一般不建議用于臨床申報和臨床樣本分析。

 

3.2.2 LC-MS/MS平臺

 

此方法檢測的原理同前面ADC藥物檢測，目前藥明康德生物分析部已建立通用型總抗體檢測的方法，圖四。該方法是通過免疫磁珠捕獲的方法對待測樣本進行富集，然后通過還原、烷基化、酶切法水解，得到其具有專屬性的肽鏈，同時使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽對其進行定量分析。方法檢測下限低至50 ng/mL，目前該方法已應(yīng)用于至少10 ADC候選藥物總抗體的測定。

 

 

圖四 LC-MS/MS平臺針對三種待測物的分析策略

 

（從左至右依次為游離小分子毒素、總抗體、DAR值分析）

 

藥明康德生物分析部致力于多平臺聯(lián)動，提供卓越的生物分析服務(wù)。針對ADC藥物，ADC藥物和總抗體的檢測，LBA和LC-MS/MS平臺各有千秋，如下表，客戶可以綜合測定需求和研究目的，有針對性的選擇檢測平臺。

 

 

3.3 小分子毒素以及毒素相關(guān)的代謝產(chǎn)物測定

 

ADC藥物進入體內(nèi)后，小分子毒素存在兩種不同形式，即游離的小分子毒素和帶有連接子和/或氨基酸殘基的小分子。一般采用常規(guī)蛋白沉淀的方法進行定量分析，也可以使用競爭ELISA方法。其中LC-MS/MS平臺可以對結(jié)構(gòu)類似物能進行有效區(qū)分，方法較LBA更簡單高效，同時更重要的是可以同時監(jiān)測/檢測代謝產(chǎn)物的水平。如果需要對活性代謝產(chǎn)物進行絕對定量，則需要提前對代謝產(chǎn)物進行鑒定并制備其標(biāo)準(zhǔn)品。

 

基于LC-MS/MS平臺，目前生物分析部已建立ADC藥物常用小分子毒素的檢測方法，如MMAE、MMAF、DM1、DM4等，結(jié)合該平臺ADC和總抗體檢測方法，大大縮減了前期方法開發(fā)的時間。

 

3.4 DAR值測定

 

DAR是描述ADC藥物的一個重要理化參數(shù)，它決定了小分子藥毒素的載荷量，同時影響藥物的安全性和有效性。每個抗體具有多個Lys/Cys位點，所以，ADC的DAR值可以是0至8，但并非DAR值越大，體外藥效越好，一般認(rèn)為DAR值大于４，越高穩(wěn)定性越差。主要原因可能由于小分子毒素的數(shù)量和疏水作用的增加會使得ADC非特異性的疏水作用增加而變得不穩(wěn)定，因此這也對ADC藥物的安全性和有效性提出了挑戰(zhàn)。

 

具有不同DAR的ADC其絕對分子質(zhì)量是不同的，因此可以據(jù)此詞用質(zhì)譜法對DAR進行分析。雖然DAR值測定有多種方法，但因為質(zhì)譜較光譜法和色譜-紫外法，具有更高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，因此質(zhì)譜法具有更大的優(yōu)勢。藥明康德生物分析團隊借助高分辨質(zhì)譜飛行時間分析器（Q-TOF）對DAR值進行準(zhǔn)確測定，目前已賦能服務(wù)多個客戶。

 

3.5免疫原性分析

 

與常規(guī)單克隆抗體一樣，ADC 作為蛋白藥物，具有免疫原性。同時由于偶聯(lián)引入了新的抗原表位，ADC 藥物有可能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更為復(fù)雜的免疫反應(yīng)，從而可能影響藥物的有效性和安全性。針對ADC藥物的臨床前免疫原性檢測，通常采用LBA平臺，常使用基于MSD平臺的橋連法（Bridge assay）對其進行半定量檢測，捕獲試劑為生物素標(biāo)記的藥物，檢測試劑為釕標(biāo)記或地高辛標(biāo)記的藥物。

 

ADA檢測的一般分為三個步驟，①篩選實驗，通過篩選割點篩選樣本是否為ADA潛在陽性樣本；②確認(rèn)實驗，通過確認(rèn)割點，競爭抑制實驗確認(rèn)潛在陽性樣本是否為ADA陽性；③滴度實驗，對確認(rèn)的陽性樣本進行滴度分析，確認(rèn)樣本中ADA陽性的程度。

 

由于ADC結(jié)構(gòu)的特殊性，針對ADC不同表位產(chǎn)生的ADA，可以是ADC分子上3個組分中的任意一個，即抗體部分、連接子或小分子毒素；也可以是它們的復(fù)合物。因此，ADC藥物的免疫原性分析應(yīng)分析針對ADC所有成分的反應(yīng)，尤其是臨床階段，需要針對ADC可能因結(jié)合產(chǎn)生的新表位的陽性抗體作為陽性對照，來開發(fā)一系列不同表位抗體檢測的方法。目前抗藥抗體不同表位分析，常采用競爭法或直接檢測的方法。結(jié)合不同表位分析，可以更好的分析臨床階段可能出現(xiàn)異常的血藥濃度降低或一些不良反應(yīng)事件的發(fā)生。

 

藥明康德生物分析團隊擁有多個技術(shù)平臺賦能客戶ADC藥物，針對不同靶點和不同的檢測需求，提供一站式服務(wù)。借助藥明康德LTD非臨床到臨床一站式生物分析服務(wù)平臺，項目可以由蘇州和上海生物分析部分別承接臨床前和臨床分析工作。非臨床和臨床團隊的積極互動，共享分析方法研究的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗，為后續(xù)臨床生物分析方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。

 

04結(jié)語和展望

 

不管是資本市場還是藥企，近年來，ADC一直是被大家關(guān)注的熱點之一。根據(jù)Nature Reviews Drug Discovery相關(guān)評論文章[13]，預(yù)計到2026年，全球已上市ADC藥物的全球銷售額將超過164億美元。在全球范圍內(nèi)，ADC風(fēng)起云涌。隨著ADC藥物技術(shù)的不斷迭代更新，為了克服耐藥性以及毒性，研發(fā)者們在各個領(lǐng)域繼續(xù)嘗試著改進，如通過新的抗體形式、新的非內(nèi)化抗原靶點、新的毒素藥物和位點特異性偶聯(lián)方式來促進ADC藥物的進一步發(fā)展。

 

隨著生物分析領(lǐng)域?qū)τ贏DC藥物研究經(jīng)驗的不斷積累，以及新的分析技術(shù)的涌現(xiàn)，將為ADC藥物血藥濃度以及免疫原性研究提供更廣闊的思路，和更精準(zhǔn)高效的分析檢測，這也將推動全球精準(zhǔn)醫(yī)療事業(yè)的蓬勃發(fā)展。

 

參考文獻：

 

1. Haiyong Peng, Perspectives on the development of antibody-drug conjugates targeting ROR1 for hematological and solid cancers. Antibody Therapeutics, 2021, Vol. 4, No. 4 222–227.

2. Walsh, SJ, Bargh, JD, Dannheim, FM et al. Site-selective modification strategies in antibody-drug conjugates. Chem Soc Rev2021; 50: 1305–53.

3. Drago, JZ, Modi, S, Chandarlapaty, S. Unlocking the potential of antibody-drug conjugates for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol 2021; 18: 327–44.

4. Dean, AQ, Luo, S, Twomey, JD et al. Targeting cancer with antibody-drug conjugates: promises and challenges. MAbs 2021; 13:1951427.

5. Jin, Y, Schladetsch, MA, Huang, X et al. Stepping forward in antibody-drug conjugate development. Pharmacol Ther 2021; 107917: 107917–40.

6. Kyoji Tsuchikama&, Zhiqiang An. Antibody-drug conjugates: recent advances in conjugation and linker chemistries. Protein Cell 2018, 9(1):33–46.

7. Carrasco-Triguero, Montserrat. Montserrat Insights on the immunogenicity of antibody-drug conjugates. July 2015 Bioanalysis 7(13):1565-1568.

8. HAMBLETT KJ，SENTER PD，CHACE DF，et al．Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate [J]. Clin Cancer Res, 2004, 10 (20):7063.

9. Yutaka Matsuda, Monica Leung, et al. A Purification Strategy Utilizing Hydrophobic Interaction Chromatography to Obtain Homogeneous Species from a Site-Specific Antibody Drug Conjugate Produced by AJICAP First Generation. Antibodies 2020, 9, 16.

10. WAKANKAR A, CHEN Y, GOKARN Y, et al. Analytical methods for physicochemical characterization of antibody drug conjugates [J]. MAbs, 2011, 3 (2): 161.

11. Jian Wang, Huidong Gu, et al. Antibody–drug conjugate bioanalysis using LB-LC–MS/MS hybrid assays: strategies, methodology and correlation to ligand-binding assays. Bioanalysis (2016) 8 (13), 1383–1401.

12. Wang Y, Heilig JS. Differentiation and quantification of endogenous and recombinant-methionyl human leptin in clinical plasma samples by immunocapture/mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 70, 440–446 (2012).

13. Carolina do Pazo, Khurram Nawaz & Rachel M. Webster. The oncology market for antibody–drug conjugates. Nature Reviews Drug Discovery 20, 583-584 (2021)