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微生物限度檢查包括微生物限度計(jì)數(shù)（用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù))及控制菌檢查（用于在特定試驗(yàn)條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物）。微生物限度試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于評(píng)估非滅菌制劑及原料、敷料是否符合藥典的規(guī)定，指導(dǎo)制劑、原料、輔料的微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，指導(dǎo)生產(chǎn)過程中間產(chǎn)品微生物質(zhì)量的監(jiān)控等。各個(gè)國家頒布了一系列的標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范微生物限度，例如《中國藥典》通則1105，《中國藥典》通則1106，《美國藥典》通則61，《美國藥典》通則62，對(duì)微生物限度檢測方法及結(jié)果判定提供了指導(dǎo)。下面，我們與大家共同探討一下微生物限度的相關(guān)內(nèi)容。

 

01微生物限度檢查的內(nèi)容有哪些？

 

1）微生物限度計(jì)數(shù)

 

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

 

供試品的微生物限度計(jì)數(shù)

 

2）微生物限度控制菌檢查

 

控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

 

供試品微生物限度控制菌檢查

 

02微生物限度計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

 

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)是為了確認(rèn)所采用的方法是否能有效地回收產(chǎn)品上/產(chǎn)品內(nèi)的微生物。下面我們來共同了解一下。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)的流程：

 

 

供試液制備

 

依據(jù)樣本的特性，選擇適宜的樣本稀釋液，將供試品制備成1:10的供試液，必要時(shí)用同一樣本稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑可以使用混合的樣品原液作為供試液。

 

接種

 

向制備的供試液中接種測試微生物，計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)的測試菌株包括：金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌和黑曲霉。按照下列方法對(duì)不同的組別進(jìn)行接種，需要注意的是，每種微生物需分別進(jìn)行接種。

 

測試組：供試液+菌懸液(菌懸液體積不大于供試液體積的1%)

 

供試液對(duì)照組(陰性對(duì)照)：供試液+樣本稀釋液

 

菌液對(duì)照組(陽性對(duì)照)：樣本稀釋液+菌懸液(同測試組)

 

注：需確保接種后每毫升供試液或每張濾膜上的菌數(shù)小于100CFU。

 

微生物回收

 

接種后可采用下列方法對(duì)供試液中的微生物進(jìn)行回收：

 

平皿法(傾注法)：向無菌平皿中加入1mL測試溶液，注入15~20mL相應(yīng)培養(yǎng)基，混勻后靜置，待培養(yǎng)基凝固后置于相應(yīng)條件下培養(yǎng)。

 

平皿法(涂布法)：向含有相應(yīng)培養(yǎng)基的平板中加入不少于0.1mL的測試溶液，使用涂布器涂布均勻，置于相應(yīng)條件下培養(yǎng)。

 

薄膜過濾法：使用孔徑0.45μm的微生物限度濾膜過濾適宜體積的測試溶液，然后使用洗脫介質(zhì)沖洗濾膜，每次沖洗量不超過100mL，最多不超過1000mL。然后將濾膜置于相應(yīng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

 

MPN法：MPN法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，且MPN法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。

 

注：當(dāng)回收率無法達(dá)到要求時(shí)，可采用以下方法消除供試品的抗菌活性：

 

1）增加樣本稀釋液或培養(yǎng)基的體積；

 

2）向樣本稀釋液或培養(yǎng)基中加入抗菌物質(zhì)的中和劑或滅菌劑；

 

3）采用薄膜過濾法通過過濾去除某些中和劑或滅菌劑；

 

4）上述幾種方法聯(lián)合使用。

 

接受準(zhǔn)則

 

試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試液對(duì)照組(陰性對(duì)照)菌落數(shù)與菌液對(duì)照組(陽性對(duì)照)菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5~2范圍內(nèi)。

 

微生物限度計(jì)數(shù)

 

測試組使用與計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)相同的方法進(jìn)行供試液制備，微生物回收和計(jì)數(shù)。使用空白樣本稀釋液作為陰性對(duì)照，使用與測試組相同的方法進(jìn)行微生物的回收和計(jì)數(shù)，陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長。

 

03控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

 

控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)是為了確認(rèn)所采用的方法能有效檢出產(chǎn)品上潛在的控制菌?？刂凭鷻z查方法適用性試驗(yàn)包含以下幾個(gè)流程：

 

 

控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)的供試液制備同計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，接種的微生物為目標(biāo)控制菌的陽性菌株，接種后在進(jìn)行不同種類的控制菌檢查時(shí)，所使用的增菌培養(yǎng)基和分離鑒定方法不同。下面列舉了各種控制菌檢測所使用的培養(yǎng)基或分離鑒定方法。

 

 

微生物限度控制菌檢查

 

使用與控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)相同的方法進(jìn)行供試液制備，增菌培養(yǎng)分離鑒定和觀察。以空白樣本稀釋液代替供試液作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長；向供試液加入≤100CFU對(duì)照菌作為陽性對(duì)照，陽性對(duì)照應(yīng)檢出相應(yīng)控制菌。