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腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞最根本的區(qū)別，在于它的原癌基因或抑癌基因發(fā)生了突變，這些突變有可能導(dǎo)致其產(chǎn)生腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigens, TSAs）和腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigens, TAAs）。

 

TSA是指腫瘤細(xì)胞有而正常細(xì)胞沒(méi)有的抗原，而TAA是指二者都有但在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的抗原。TSA和TAA很好地區(qū)分了腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，于是單克隆抗體療法出現(xiàn)了。

 

早期的單抗都是鼠源或嵌合抗體，因此免疫原性就比較強(qiáng)，再加上抗體分子量較大，導(dǎo)致其腫瘤滲透率很差。后來(lái)抗體工程的發(fā)展解決了這些問(wèn)題，但是單克隆抗體對(duì)腫瘤的治療效果還是不盡如人意。

 

于是，人們將抗體的特異性和化療藥的毒性結(jié)合到一起，產(chǎn)生了抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugates, ADCs）。ADC主要由三個(gè)部分組成：抗體、連接子和毒素。

 

早期的ADC利用腫瘤微環(huán)境的差異性（如特定的酶、pH等）來(lái)釋放毒素，這種方式導(dǎo)致ADC產(chǎn)生較大的毒性。新型的ADC則是利用細(xì)胞的內(nèi)化作用，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)部再釋放毒素，從而大大減少了毒性。

 

本文將帶你系統(tǒng)地了解ADC的方方面面，以及它的最新研究動(dòng)向。

 

01、ADC作用機(jī)制

 

胃酸和蛋白酶會(huì)對(duì)ADC造成破壞，因此它只能通過(guò)靜脈注射方式給藥。ADC進(jìn)入血液循環(huán)后隨血液到達(dá)全身，當(dāng)它與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合后，就會(huì)發(fā)生內(nèi)化作用，即細(xì)胞膜產(chǎn)生凹陷，最終向內(nèi)生成一個(gè)小球，稱內(nèi)吞體（endosome）。

 

內(nèi)吞體的外表面包裹著一層網(wǎng)格蛋白，內(nèi)表面存在一些Fc受體（FcRns），由于H+的內(nèi)流，內(nèi)吞體內(nèi)部形成酸性環(huán)境，促進(jìn)ADC與FcRn的結(jié)合，這些與FcRn結(jié)合的ADC會(huì)被重新運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，pH回到了7.4，這時(shí)二者又分離，釋放出ADC。這一機(jī)制可以減少ADC對(duì)正常細(xì)胞的傷害，但同時(shí)也會(huì)影響其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。FcRn主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)吞體中。

 

剩下那些沒(méi)有結(jié)合FcRn的ADC最終保留在內(nèi)吞體中，隨著內(nèi)吞體與溶酶體的融合，這些ADC被溶酶體中的各種酶降解，釋放出毒素分子。這些毒素分子有的直接殺死腫瘤細(xì)胞，有的則通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡將其消滅。此外，將靶細(xì)胞殺死后，毒素分子還能繼續(xù)發(fā)揮作用，殺死相鄰的腫瘤細(xì)胞以及腫瘤的支撐性組織。

 

從血液循環(huán)到最終釋放毒素分子，每一步都會(huì)有ADC的損失，因此ADC只有達(dá)到一定的濃度，才能保證最后有足夠量的毒素分子發(fā)生效應(yīng)。

 

02、靶點(diǎn)選擇

 

在設(shè)計(jì)一款A(yù)DC藥物之前，得先確定靶點(diǎn)。靶點(diǎn)必須是腫瘤特異性的，或者在腫瘤中高表達(dá)的。吉妥單抗的失敗就是因?yàn)樗陌悬c(diǎn)抗原CD33表達(dá)量過(guò)低。但是，光滿足這一點(diǎn)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。它還得有足夠的能力驅(qū)動(dòng)內(nèi)化作用，具有較高的表達(dá)量以及外顯率。

 

腫瘤特異性抗原是最理想的靶點(diǎn)，但事實(shí)上大多數(shù)靶點(diǎn)都是腫瘤相關(guān)抗原，因此得保證它們?cè)谡＜?xì)胞中的表達(dá)量盡可能地低。

 

PSMA在正常前列腺細(xì)胞中只表達(dá)于細(xì)胞漿，而在前列腺癌細(xì)胞中則會(huì)暴露于細(xì)胞外；HER2在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中表達(dá)量很少。因此這兩種抗原都可以作為ADC的靶點(diǎn)。

 

抗原驅(qū)動(dòng)內(nèi)化作用的能力取決于抗原的種類和毒素分子的種類。有些抗原不管有沒(méi)有結(jié)合抗體，都會(huì)頻繁地發(fā)生內(nèi)化作用，但有些就一直待在細(xì)胞膜上不會(huì)動(dòng)，而前者才可以將ADC帶入細(xì)胞內(nèi)。

 

除了抗原自身與其內(nèi)化作用相關(guān)外，毒素種類也會(huì)影響抗原的內(nèi)化作用。例如，CD20正常情況下不會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)化作用，當(dāng)利妥昔單抗連接阿霉素/澳瑞他汀時(shí)，不發(fā)生內(nèi)化，當(dāng)連接卡奇霉素時(shí)又可以發(fā)生內(nèi)化。

 

還有一種情況，當(dāng)抗原在腫瘤細(xì)胞通路中發(fā)揮作用時(shí)，影響腫瘤細(xì)胞的正常生理功能，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。比如T-DM1中的曲妥珠單抗，在特異性結(jié)合HER2后可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

 

腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)最常見(jiàn)的就是位于細(xì)胞表面的蛋白，事實(shí)上我們還可以把目光放到腫瘤細(xì)胞之外的附屬組織，比如新生血管和細(xì)胞外基質(zhì)組織，這些組織保證了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，因此，破壞這些組織可以間接地抑制腫瘤生長(zhǎng)，典型的例子有成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）和蛋白酪氨酸激酶7（protein tyrosine kinase 7, Ptk 7）。

 

03、單克隆抗體選擇

 

抗體的任務(wù)是讓ADC具有高靶標(biāo)特異性、高靶標(biāo)結(jié)合力以及在腫瘤部位的持久暴露?；谶@些原則，我們選擇的抗體：1）不能和正常細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)，2）活性要在納摩爾或者皮摩爾級(jí)別，3）具有較長(zhǎng)的半衰期，4）盡可能小的免疫原性。

 

ADC的靶標(biāo)特異性差不僅導(dǎo)致對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性，還會(huì)因免疫原性加快血漿清除速度。免疫原性是影響血漿清除速度的主要因素。早期的ADC，其抗體都是鼠源或嵌合抗體，因此免疫原性很強(qiáng)，很快就會(huì)被清除，無(wú)法發(fā)揮作用，所以現(xiàn)在使用的抗體基本都是人源化的或者人源抗體。

 

抗體占ADC總質(zhì)量的90%以上，抗體的大小決定了ADC的滲透性。血管內(nèi)皮只有一層細(xì)胞，普通血管的分支較少，內(nèi)皮細(xì)胞排列相對(duì)緊密，大分子無(wú)法透過(guò)，但腫瘤組織內(nèi)的血管分支很多，內(nèi)皮細(xì)胞排列疏松，像ADC這種大分子也可以輕松透過(guò)，因此可以較好地進(jìn)入到腫瘤組織。

 

與此同時(shí)，要保證像肝、腸、皮膚等代謝性和清除性器官不能透過(guò)ADC，這樣才能將ADC截留在血液循環(huán)中，增加其半衰期。除此之外還有一種因素會(huì)影響ADC的半衰期，那就是FcRn，ADC-FcRn復(fù)合物可以使ADC重新回到血液循環(huán)或者腫瘤組織間液中，再次利用。

 

單抗的作用機(jī)制有兩種，一種是直接阻斷腫瘤細(xì)胞的通路（如曲妥珠單抗），另一種則是通過(guò)激活免疫細(xì)胞來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，如ADCC、CDC、CDCC等。后者的最終效果很大程度上與抗體的亞型有關(guān)，但不管是哪種亞型，都存在各種問(wèn)題。為此，人們開(kāi)始設(shè)計(jì)雙特異性抗體，例如卡妥索單抗可同時(shí)靶向腫瘤細(xì)胞的EpCAM抗原和T細(xì)胞的CD3抗原，從而促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

 

04、連接子

 

連接子的任務(wù)是保證ADC在血液循環(huán)中穩(wěn)定不斷裂，而在腫瘤組織中又能斷裂釋放出毒素分子。在設(shè)計(jì)連接子時(shí)需要考慮：1）連接子的可斷裂性2）連接位點(diǎn)3）連接機(jī)制。

 

連接子大致分為可裂連接子和不可裂連接子兩種?？闪堰B接子依賴腫瘤微環(huán)境的特異性來(lái)使ADC發(fā)生斷裂。腙連接子利用溶酶體中較低的pH值，發(fā)生酸水解，從而釋放毒素分子。二硫鍵連接子容易被谷胱甘肽分解，而腫瘤細(xì)胞中的谷胱甘肽含量較高。

 

還有一種是酶不穩(wěn)定連接子（或肽連接子），它通過(guò)二肽將抗體與毒素分子連接，由于打破肽鏈的酶只在低pH環(huán)境下發(fā)揮作用，因此這種連接子不會(huì)在腫瘤之外的中性區(qū)域斷裂。臨床試驗(yàn)表明，與腙連接物相比，酶不穩(wěn)定連接物具有更高的特異性、更高的穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的半衰期，因此毒性相對(duì)更小。

 

與之不同的是，不可裂連接子依賴于內(nèi)化后的溶酶體裂解作用。溶酶體中的蛋白酶分解單克隆抗體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，最后留下一個(gè)氨基酸（通常是賴氨酸或半胱氨酸）仍然附著在連接體和細(xì)胞毒素上。由此產(chǎn)生的氨基酸-連接物-細(xì)胞毒素復(fù)合物釋放到細(xì)胞質(zhì)中，成為活性藥物。

 

連接子確定后，還需要確定藥物-抗體比率（DAR），按道理DAR值越高效果越好，但事實(shí)遠(yuǎn)非這么簡(jiǎn)單，過(guò)度的藥物結(jié)合導(dǎo)致ADC容易發(fā)生聚集并被識(shí)別為外來(lái)蛋白，增加其清除率和免疫原性增加。研究表明，每個(gè)單抗負(fù)載2-4個(gè)毒素分子最為合適，在清除率和最大效力之間達(dá)到了最佳平衡。

 

不可裂連接子具有更好的穩(wěn)定性，因此采用這類連接子的ADC半衰期更長(zhǎng)，副作用風(fēng)險(xiǎn)降低，同時(shí)保留活性。但另一方面，可裂連接子可能產(chǎn)生一種旁觀者效應(yīng)（bystander effect）, 旁觀者效應(yīng)通常是由疏水性細(xì)胞毒素的細(xì)胞外流引起的，它可以從抗原陽(yáng)性的靶細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入相鄰抗原陰性的健康細(xì)胞。

 

盡管旁觀者效應(yīng)破壞了ADC的靶向特異性，但在治療缺乏靶抗原同質(zhì)表達(dá)的實(shí)體瘤時(shí)，這種效應(yīng)卻是有利的。旁觀者效應(yīng)僅發(fā)生在可裂連接子，因?yàn)椴豢闪堰B接子分解形成的氨基酸-細(xì)胞毒素復(fù)合物帶電，因此不能穿過(guò)靶細(xì)胞的疏水性脂質(zhì)雙層。

 

05、偶聯(lián)技術(shù)

 

傳統(tǒng)的ADC偶聯(lián)方法是將毒素分子直接與抗體連接，通過(guò)半胱氨酸的巰基（圖A）或賴氨酸的氨基（圖B）相連，它的缺點(diǎn)是連接位置和數(shù)量受限于抗體蛋白的序列。而且生產(chǎn)出來(lái)的ADC質(zhì)量不一，有的抗體連接上了毒素而有的沒(méi)連接上，除了影響療效，沒(méi)有連接毒素的抗體還會(huì)對(duì)抗原進(jìn)行占位，進(jìn)一步影響ADC發(fā)揮作用。

 

為此，人們?cè)趩慰沟奶囟ㄎ恢靡脒x擇性反應(yīng)分子，這樣可以控制藥物附著的部位和數(shù)量，并可能增加ADC的治療窗口，同時(shí)降低毒性并改善藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。這種策略主要有三種結(jié)合技術(shù)，分別是：1）通過(guò)未配對(duì)半胱氨酸殘基接合2）通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶接合3）通過(guò)非天然氨基酸接合。

 

通過(guò)未配對(duì)半胱氨酸殘基接合（圖C）。這種方法依賴于定點(diǎn)突變，即在單克隆抗體的特定位點(diǎn)引入固定數(shù)量的半胱氨酸。這一過(guò)程保持了天然半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，同時(shí)避免了ADC異質(zhì)性問(wèn)題。

 

通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶接合（圖D）。這種方法首先將單抗的特定位點(diǎn)修飾為谷氨酰胺，再利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶將含胺的細(xì)胞毒素結(jié)合到該位點(diǎn)上。它的主要優(yōu)點(diǎn)是這種酶不識(shí)別原本的天然氨基酸，而是與谷氨酰胺標(biāo)簽序列相互作用，該標(biāo)簽序列可通過(guò)質(zhì)粒并入單克隆抗體。由于單抗上可能的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量增加，這種技術(shù)可以更好地控制藥物結(jié)合。

 

通過(guò)非天然氨基酸接合（圖E）。非天然氨基酸在結(jié)構(gòu)上與天然氨基酸非常相似，是利用基因密碼子拓展技術(shù)，將含有一些生物正交官能團(tuán)的非天然氨基酸引入到蛋白質(zhì)中，然后在偶聯(lián)藥物，具有定點(diǎn)可控，操作方面，產(chǎn)品質(zhì)量均一的優(yōu)勢(shì)，比如目前在臨床三期的ARX788。

 

06、毒素

 

ADC的毒素也需要滿足很多特性。首先，由于ADC通常在水溶液中制備并經(jīng)靜脈給藥，因此毒素分子需要有較好的穩(wěn)定性。第二，毒素的活性最好能達(dá)到皮摩爾級(jí)別，即常規(guī)化療藥物的100–1000倍，因?yàn)樽罱K只有一小部分ADC到達(dá)腫瘤細(xì)胞。第三，依賴溶酶體釋放的毒素需要耐低pH，否則在到達(dá)效應(yīng)部位之前就已失效。

 

目前細(xì)胞毒素大致分為澳瑞他汀、美登素、卡奇霉素，以及不太常用的duocarymycins和PBD二聚體。前兩種都是通過(guò)干擾細(xì)胞周期來(lái)抑制細(xì)胞分裂，其中澳瑞他?。ㄈ鏜MAE、MMAF）通過(guò)抑制微管蛋白上的GTP轉(zhuǎn)化為GDP，導(dǎo)致微管的過(guò)度生長(zhǎng)；美登素（如DM1、DM4）則是通過(guò)結(jié)合微管的生長(zhǎng)端，阻止微管的成熟，最終影響細(xì)胞的分裂。

 

而卡奇霉素、duocarymycins和PBD二聚體則會(huì)導(dǎo)致DNA損傷。這些毒素分子最終都會(huì)誘導(dǎo)凋亡導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。

 

07、展望

 

歷經(jīng)幾十年，ADC已經(jīng)有了巨大的發(fā)展，但它依然面臨著不小的挑戰(zhàn)。一方面導(dǎo)致ADC療效不夠的因素很多，另一方面ADC對(duì)正常細(xì)胞的傷害依然無(wú)法完全避免。組成ADC的三個(gè)主要部件都會(huì)影響它的療效和副作用，如何同時(shí)優(yōu)化三者達(dá)到最佳效果，目前還是一個(gè)難題。

 

盡管在設(shè)計(jì)上存在挑戰(zhàn)，ADC還是為癌癥療法提供了新的思路，并有望成為未來(lái)精準(zhǔn)醫(yī)療的重要組成部分。