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細(xì)菌內(nèi)毒素（Bacterial-Endotoxins）是一種高分子量的脂多糖成分，分布于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁上，如果進(jìn)入人體的血液或組織中能夠?qū)е掳l(fā)熱、腦膜炎和血壓快速降低等癥狀。細(xì)菌內(nèi)毒素污染很難預(yù)防，因?yàn)樗毡榇嬖谟谧匀画h(huán)境中，穩(wěn)定而且體積小，能夠穿透傳統(tǒng)的無菌過濾器。國家藥監(jiān)局規(guī)定對(duì)于特殊的醫(yī)療器械，出廠前必須進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。無菌醫(yī)療器械初包裝與產(chǎn)品直接接觸，其潔凈度直接影響到產(chǎn)品潔凈度，因此初包裝上的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查對(duì)產(chǎn)品安全也至關(guān)重要。本文主要介紹細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法及其應(yīng)用。

 

一、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查發(fā)展歷程

 

現(xiàn)在細(xì)菌內(nèi)毒素最常用的檢查法一般是鱟試劑試驗(yàn)法。1964 年由美國學(xué)者 Levin 和 Bang 發(fā)現(xiàn)微量革蘭陰性菌內(nèi)毒素可以引起凝膠反應(yīng)，從而在1968年創(chuàng)立了一種定性或定量檢測微量細(xì)菌內(nèi)毒素的體外分析方法(鱟試劑檢測法)。由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)而且操作簡便、快捷，目前在許多領(lǐng)域得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，其應(yīng)用已深入到藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)以及臨床檢驗(yàn)等各個(gè)領(lǐng)域。1980年，《美國藥典》第20版首先收載鱟試劑法作為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，隨后歐洲、日本藥局等各方也相繼收載了這一方法。1995年，《中國藥典》1995版二部附錄收載了修訂后的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。2003年，細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測開始在我國臨床全面開展應(yīng)用。

 

二、醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素檢查相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

 

Ø GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具 檢驗(yàn)方法 第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法；

 

Ø《中國藥典》2020年版 1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

 

三、檢查用試劑

 

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、

 

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

 

四、檢查設(shè)備

 

超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、電熱干燥箱、漩渦混合器。

 

五、試驗(yàn)前準(zhǔn)備

 

Ø 器具處理

 

試驗(yàn)所用器皿需經(jīng)處理除去可能存在的外源性細(xì)菌內(nèi)毒素。耐熱器皿置電熱干燥箱內(nèi)250℃干烤至少30 min。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無細(xì)菌內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無干擾的器具。

 

Ø 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

 

當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。

 

Ø 供試品干擾試驗(yàn)

 

對(duì)未知或可疑的供試品初次進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)之前應(yīng)先進(jìn)行干擾試驗(yàn)，以檢驗(yàn)供試品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)是否有抑制或增強(qiáng)作用，以及其他影響細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)準(zhǔn)確性和敏感性的干擾作用。當(dāng)鱟試劑、供試品來源、供試品配方或生產(chǎn)工藝有變化或其他任何可能影響細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)結(jié)果的試驗(yàn)條件改變時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

 

六、試驗(yàn)方法

 

Ø 供試品數(shù)量

 

同一批號(hào)至少3個(gè)單位供試品

 

Ø 浸提介質(zhì)

 

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

 

Ø 供試品液制備

 

根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定浸提介質(zhì)體積，選擇下列適用方法制備供試液：

 

a）管類和容器類器具用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水浸泡器具內(nèi)腔，在（37±1）℃恒溫箱中浸提不少于1 h;

 

b) 小型配件或?qū)嶓w類器具置無熱原玻璃器皿內(nèi)，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水振搖數(shù)次，在（37±1）℃恒溫箱中浸泡不少于1 h。

 

注：供試液貯存應(yīng)不超過2 h。

 

Ø 檢查方法

 

鱟試驗(yàn)法則是目前最常用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法。我國藥典收載的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法為鱟試驗(yàn)法，鱟試驗(yàn)法有定性和定量之分，其按試驗(yàn)方法還可進(jìn)一步分為凝膠法、動(dòng)態(tài)濁度法、終點(diǎn)濁度法、動(dòng)態(tài)顯色法和終點(diǎn)顯色法。當(dāng)各種檢測法得到的檢測結(jié)果不一致時(shí)，以凝膠法的檢測結(jié)果為準(zhǔn)。

凝膠法系應(yīng)用鱟試劑可與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)的原理來定性或半定量檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的一種鱟試驗(yàn)法，檢測時(shí)鱟試劑須以除熱原水（細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水）復(fù)溶后使用，通過觀察有無凝膠形成作為檢測終點(diǎn)。凝膠法檢測操作簡便、經(jīng)濟(jì)，不需使用專用檢測設(shè)備。本試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止細(xì)菌內(nèi)毒素的污染。

動(dòng)態(tài)濁度法、終點(diǎn)濁度法、動(dòng)態(tài)顯色法和終點(diǎn)顯色法都是細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測方法。動(dòng)態(tài)濁度法和終點(diǎn)濁度法都屬濁度法。濁度法是通過檢測鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化來檢測細(xì)菌內(nèi)毒素含量的鱟試驗(yàn)法。動(dòng)態(tài)顯色法和終點(diǎn)顯色法都屬顯色基質(zhì)法。顯色基質(zhì)法是通過檢測鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物游離出生色團(tuán)的多少來檢測細(xì)菌內(nèi)毒素含量的鱟試驗(yàn)法，根據(jù)產(chǎn)物色度計(jì)算細(xì)菌內(nèi)毒素水平，又被稱為比色法。

 

七、試驗(yàn)報(bào)告

 

試驗(yàn)報(bào)告中宜給出下列信息：

 

a） 供試品名稱;

 

b） 生產(chǎn)批號(hào);

 

c） 供試液制備方法;

 

d） 細(xì)菌內(nèi)毒素限量;

 

e） 結(jié)果判定。

 

八、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用

 

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法現(xiàn)除可用于初包裝檢查，還被廣泛用于檢測藥品、醫(yī)療器械以及工藝用水等不同樣本中的細(xì)菌內(nèi)毒素。

 

Ø 藥品中的應(yīng)用

 

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法還用于各種藥品的質(zhì)量控制，在醫(yī)藥工業(yè)的GMP條件下，“熱原就是內(nèi)毒素，控制內(nèi)毒素就是控制熱原”已成為共識(shí)，用細(xì)菌內(nèi)毒檢查法代替熱原法也符合動(dòng)物福利的3Ｒ原則，因此細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在今后的應(yīng)用會(huì)越來越多。

 

Ø 輸液器及外科手術(shù)器材

 

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法已廣泛用于臨床一次性使用輸液輸血器具、無菌注射器、無菌注射針及外科手術(shù)器材等的檢查。

 

Ø 臨床中輔助診斷

 

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的敏感性和特異性都很高，對(duì)診斷革蘭陰性菌所致敗血癥、內(nèi)毒素血癥、泌尿系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染均有一定意義，有助于早期判斷感染類型，有利于指導(dǎo)臨床用藥及判斷預(yù)后。

 

總結(jié)

 

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查主要通過鱟試驗(yàn)法來進(jìn)行，分為凝膠法和光度測定法，后者又分為濁度法和顯色基質(zhì)法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查不僅可以用于無菌醫(yī)療器械初包裝潔凈度評(píng)價(jià)，也廣泛應(yīng)用于藥品、醫(yī)療器械等樣本的內(nèi)毒素監(jiān)測，同時(shí)還可用于臨床患者的細(xì)菌內(nèi)毒素監(jiān)測，為其臨床診治提供參考。

 

【參考資料】

 

GB/T 14233.2-2005；細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法及其臨床應(yīng)用[J].上海醫(yī)藥,2018,39(21):3-6