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隨著毒理學學科的延伸與發(fā)展，越來越多的研究工具和評估方法被開發(fā)出來，以替代傳統(tǒng)的動物試驗，一方面能更好地保障動物福利，另一方面也可以實現(xiàn)更高通量的評估效率。

 

這些替代方法包括了化學測試（in chemico）、體外測試（in vitro）和計算機模擬（in silico），并可應用于皮膚致敏、皮膚刺激/腐蝕、基因毒性等毒性節(jié)點方面。

 

但是在不少替代方法的實際使用過程中，受限于單個方法本身的局限性，通常需要采用多組替代方法并結合專家評價的方式得出最終的結論以用于法規(guī)需求。

 

為了提高替代方法在化學品法規(guī)應用方面的適用性與規(guī)范性，經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）于2021年7月首次發(fā)布了一類限定方法（Defined Approach, DA）來用于評價化學品的皮膚致敏性。

 

該方法被采納為OECD TG 497，主要基于皮膚致敏的有害結局（Adverse Outcome Pathway, AOP）框架，通過限定的幾組替代方法采用規(guī)范化流程來完成對目標化合物評估致敏性的評價。

 

有害結局路徑與皮膚致敏作用機制

 

有害結局路徑 AOP 最核心的內(nèi)容在于規(guī)范化和模塊化了從分子、細胞、組織、器官及至最終個體與群體水平的一系列毒性發(fā)生事件，并強調(diào)以邏輯推理性來確定這些毒性發(fā)生事件的前后關系。

 

在AOP框架中，毒性事件可以具體分為分子起始事件（Molecular Initiating Event, MIE; 在OECD指南中也被定義為Key Event 1， KE1），關鍵事件（Key Events, KEs）和有害結局（Adverse Outcome, AO）這三大類，而各個過程則是通過關鍵事件關系（Key Event Relationships, KERs）進行連接。

 

簡單地來說，皮膚致敏事件可以理解為由一個分子起始事件開始，從而導致多個關鍵事件的發(fā)生，最后終結于“過敏性接觸性皮炎”這一有害效應的過程。

 

皮膚致敏限定方法的開發(fā)即是建立于皮膚致敏的AOP框架之中（AOP ID: 40; OECD Project: 1.1），皮膚致敏過程分為誘導階段和隨后的免疫反應激發(fā)階段。

 

第一個階段主要的分子起始事件（MIE, 即KE1）為外源物質(zhì)與皮膚蛋白的共價結合，形成半抗原。

 

隨后觸發(fā)了兩個細胞水平的關鍵事件（KEs），其中KE2為角質(zhì)細胞炎癥反應；KE3則是樹突狀細胞的激活。

 

第三個關鍵事件（KE4）則發(fā)生在器官水平，其過程為KE3中經(jīng)活化的樹突狀細胞遷移至局部淋巴結，并向初始型T細胞遞呈組織相容性復合物（MHC），從而導致記憶T細胞的增殖與分化。

 

而一旦此個體的皮膚再次接觸原外源化合物時，則會進入免疫反應激發(fā)階段，最終造成有害結局（AO）：過敏性接觸性皮炎的發(fā)生。

 

 

皮膚致敏的AOP框架

 

 

皮膚致敏過程的誘導階段

 

 

皮膚致敏過程的激發(fā)階段

 

與關鍵事件相關的皮膚致敏試驗方法

 

基于已建立的皮膚致敏的AOP框架，截止到目前針對于KEs已經(jīng)有開發(fā)了一系列測試方法，且部分已被OECD測試指南收錄為標準方法。針對這部分被OECD測試指南收錄的方法總結如下：

 

 

限定方法與整合測試和評估方法

 

雖然基于皮膚致敏AOP框架已開發(fā)了上述一系列的體外測試方法，但由于皮膚致敏反應機制涉及多因素、多水平的復雜分子生物學過程，因此單一的體外測試方法并不能保障對目標化合物的皮膚致敏性有足夠的預測能力。

 

基于這一原因，皮膚致敏整合測試和評估方法（IATA）應運而生。

 

具體而言，IATA運用了多組體外測試結果并結合了專家評價來綜合判斷目標化合物是否具有皮膚致敏性，但顯而易見的是這種方式并不能完全適用于法規(guī)需求中的決策目的，最主要的影響條件在于不同專家評價結果可能會導致開放性的結論，造成無法對目標化合物的皮膚致敏性評估達成統(tǒng)一性判斷。

 

為了讓替代方法更能夠滿足法規(guī)需要，逐漸發(fā)展而來的限定方法（Defined Approach, DA）與IATA最大的差異在于不再依賴專家評價，僅采用限定的幾組體外試驗結果，即可對目標化合物完成致敏性評估。

 

除此之外，通過按規(guī)定流程結合(Q)SAR預測的方式，DA也能夠進一步得出法規(guī)所需的統(tǒng)一危害分類結果。

 

皮膚致敏限定方法OECD TG 497的評估流程

 

在OECD TG 497中，皮膚致敏性的限定方法主要有如下3種：

 

01

 

從一組in chemico 試驗（KE1, OECD TG 442C: DPRA）和兩組

 

in vitro 試驗（KE2, OECD TG 442D: KeratinoSensTM ; KE3, OECD TG 442E: h-CLAT）中采用“3選2（2o31）”的限定方法對目標化合物的皮膚致敏性進行危害識別。

 

02

 

通過采用一組in chemico試驗（KE1, OECD TG 442C: DPRA）、一組in vitro試驗（KE3, OECD TG 442E: h-CLAT）與一組in silico方法（Derek Nexus）的結果形成整合測試策略（ITSv12），基于EG DASS3專家組發(fā)展而來的數(shù)據(jù)解釋步驟（DIP4）來對目標化合物的皮膚致敏性得出UN GHS危害分類結論。

 

03

 

通過采用一組in chemico試驗（KE1, OECD TG 442C: DPRA）、一組in vitro試驗（KE3, OECD TG 442E: h-CLAT）與一組in silico方法（OECD QSAR Toolbox）的結果形成整合測試策略（ITSv22），基于EG DASS3專家組發(fā)展而來的數(shù)據(jù)解釋步驟（DIP4）來對目標化合物的皮膚致敏性得出UN GHS危害分類結論。

 

1 2o3: 3選2（2 out of 3）

 

2 ITSv1或ITSv2: 整合測試策略v1或v2（integrated testing strategy version 1 or version 2）

 

3 EG DASS: 皮膚致敏限定方法開發(fā)專家組（Expert Group on Defined Approaches for Skin Sensitisation）

 

4 DIP: 數(shù)據(jù)解釋步驟

 

（Data interpretation procedure）

 

 

2o3皮膚致敏限定方法的決策樹

 

 

ITSv1/ITSv2皮膚致敏限定方法的決策樹

 

皮膚致敏限定方法的性能評估

 

雖然受限于數(shù)據(jù)集的大小，但在OECD TG 497中也盡可能地評估了三種限定方法對皮膚致敏的預測性能（如下圖所示）。

 

可以發(fā)現(xiàn)的是當前這三種限定方法已在準確度（Balanced Accuracy, BA）、靈敏度（Sensitivity, Sens）和特異性（Specificity, Spec）方面均基本能滿足法規(guī)需求，且與IATA相比也不再需要額外的專家評價，因此該限定方法的開發(fā)極大提升了替代方法應用于皮膚致敏評估時的適用性與規(guī)范性。

 

但仍需要注意的是這些限定方法仍受限于具體的替代方法本身（如DPRA, KeratinoSensTM和h-CLAT對于Log P > 3.5的目標化合物預測靈敏度較低；金屬化合物不適用于DPRA試驗等），以及當出現(xiàn)不明確的結論時還需要進一步的分析策略。

 

 

三種限定方法與LLNA方法在預測OECD標準物質(zhì)致敏性的表現(xiàn)