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一、考察離子化合物的pKa值

 

　　在反相色譜分析中通常不要求化合物精確的pKa值，我們可以通過查閱文獻(xiàn)或者根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)按照下圖中列出的主要酸堿官能團(tuán)在水溶液的pKa值進(jìn)行推測。

 

　　注意：按照上表中官能團(tuán)進(jìn)行估算時分子中相鄰基團(tuán)的不同會導(dǎo)致pKa出現(xiàn)1-2個單位的差異。對于酸性化合物，當(dāng)含有吸電子基團(tuán)時會導(dǎo)致酸性增強(qiáng)，pKa值相應(yīng)降低;對于堿性化合物，當(dāng)含有吸電子基團(tuán)時會導(dǎo)致堿性降低，pKa值相應(yīng)降低。

 

 

二、根據(jù)化合物pKa值推測流動相相應(yīng)使用的pH

 

　　先看下流動相pH對酸堿化合物的影響：流動相pH對不同pKa化合物的保留時間的影響

 

 

 

　　根據(jù)這幅圖，我們可以看出，當(dāng)流動相的pH約等于化合物的pKa時，可以最大限度的調(diào)整化合物的保留時間。此時改變0.1個單位的pH可以使得保留因子k變化10%，可引起分離度±2.5個單位的變動。但此時需要進(jìn)行精確控制流動相的pH，這要求把流動相pH控制在0.02個單位以內(nèi)，在實驗室很難控制，重現(xiàn)性較差，成為分析的瓶頸。

 

　　但我們實驗時可以將pH范圍放寬，只要將流動相pH控制在化合物pKa值±1.5個單位的范圍內(nèi)(上圖所示的II范圍內(nèi))就可以對化合物保留行為產(chǎn)生比較明顯的影響，此時進(jìn)行分離選擇性較好。同時為了更好地控制保留行為的重現(xiàn)性，需要控制緩沖液的pH在±0.1個單位以內(nèi)(當(dāng)流動相pH控制范圍較窄時建議使用緩沖鹽的質(zhì)量進(jìn)行控制，比pH計進(jìn)行控制效果更優(yōu))。

 

　　通過以上三點分析我們可以得出，待分析化合物的pKa與確定流動相的pH有很大的關(guān)系。主要依據(jù)化合物出峰時間、化合物的峰型及所需要分離目標(biāo)的化合物綜合考慮來確定流動相的pH。

 

　　可能有的同事會發(fā)現(xiàn)第二點和第三點是有些矛盾的，這時候就需要對自己的實驗進(jìn)行初步的探索，看看是否pH值會對化合物的峰型產(chǎn)生影響(有的專家認(rèn)為該觀點缺乏理論和實踐的支持)或者是否需要準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH在化合物pKa±1.5范圍內(nèi)進(jìn)行提高選擇性。

 

　　筆者在做實驗時發(fā)現(xiàn)有的物質(zhì)會因稀釋液pH使用不當(dāng)產(chǎn)生峰分叉的現(xiàn)象，調(diào)節(jié)稀釋液的pH即可解決峰的分叉;有時流動相pH在化合物的pKa±2的范圍內(nèi)時離子化合物并沒有出現(xiàn)峰分叉、峰型不好現(xiàn)象。

 

三、根據(jù)流動相pH值測定所需要的緩沖鹽

 

　　1.緩沖液選擇主要依據(jù)：

 

　　(1)緩沖溶液的pKa和緩沖容量

 

　　(2)溶解度

 

　　(3)紫外吸收

 

　　2.對以上三點進(jìn)行說明

 

　　(1)一般緩沖溶液的pKa值與流動相的pH相等時緩沖能力最大，pKa與流動相的pH相差越大，緩沖液的緩沖能力越差。一般要求流動相的pH與緩沖液的pKa值不能超過±1.0個單位，當(dāng)緩沖溶液濃度較高時可以放寬范圍到1.5個單位。常用的緩沖液的緩沖范圍見下圖：

 

 

　　緩沖溶液的濃度一般在5-50mmol，因過低導(dǎo)致緩沖能力不足(可通過調(diào)整進(jìn)樣體積查看化合物峰型的變化，如果出現(xiàn)拖尾或者前沿現(xiàn)象，說明緩沖溶液的能力不足);緩沖液濃度過大會導(dǎo)致與有機(jī)相混溶時鹽的析出，對儀器、色譜柱都會產(chǎn)生損傷，而且使得基線不好。一般初始摸索方法時推薦使用25mmol。

 

　　(2)根據(jù)緩沖液溶解度：在酸性緩沖溶液中，如磷酸鹽，緩沖液溶解度順序：鈉鹽<鉀鹽<銨鹽;有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH=7時10mmol的磷酸鉀在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3時，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解(此測試通過使用容器將不同比例的混合溶劑進(jìn)行混合，觀察大約30min，是否有沉淀產(chǎn)生，否則就要降低緩沖液的濃度或者有機(jī)相的含量，在梯度洗脫時尤為注意)。

 

　　(3)根據(jù)化合物的吸收波長：在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸鹽緩沖液是不錯的選擇。而甲酸鹽和乙酸鹽緩沖液的范圍是2.5～6.0，適用于210納米或者更高吸收的檢測波長。

 

　　3. 緩沖鹽的作用：

 

　　緩沖鹽的種類或者濃度對選擇性的改變會很小，只是起到緩沖作用，提高化合物的保留時間的穩(wěn)定性。

 

　　高效液相色譜法中選擇緩沖鹽的注意事項

 

　　在高效液相色譜法中，分離酸或堿緩沖溶液對維持流動相恒定pH和提高保留時間的重現(xiàn)性都非常重要。

 

　　怎么選擇緩沖液：

 

　　● Pka和緩沖容量

 

　　● 溶解度

 

　　● 紫外吸光度(使用UV檢測器)

 

　　● 揮發(fā)性(MS蒸發(fā)光散射檢測器)

 

　　● 離子對性質(zhì)

 

　　● 穩(wěn)定性和儀器的兼容性

 

　　根據(jù)以上的理論，流動相緩沖容量取決于緩沖鹽的pka，緩沖鹽濃度，流動相pH。

 

　　當(dāng)緩沖液中溶質(zhì)的的兩種形態(tài)(HA和 A-)濃度相等時，即緩沖鹽的pka與流動相pH相等時，緩沖能力最大。當(dāng)流動相的pH與緩沖鹽的pka相差越大，緩沖鹽的緩沖容量就越小。因此緩沖的pka與流動相的pH相差不能超過±1.0個單位。

 

　　流動相的緩沖容量一般與緩沖液濃度成正比關(guān)系，通常濃度范圍為5~25mmol/l。

 

　　樣品溶解在流動相中可以避免在反相色譜過程中發(fā)生緩沖能力的問題，尤其是流動相緩沖液濃度較低或注入樣品量較大的時候尤為重要。

 

　　當(dāng)緩沖容量偏低時，可以從以下方面調(diào)節(jié)緩沖容量：

 

　　1、減少緩沖液pKa與流動相pH之間的差異(可調(diào)節(jié)pH或更換緩沖液)

 

　　2、礦大流動相pH和溶質(zhì)pKa之間的差異(當(dāng)差異足夠大時，溶質(zhì)倍完全離子化或者保持非離子化形式此時緩沖液顯的不重要了)

 

　　3、增加緩沖液濃度

 

　　4、減少樣品進(jìn)樣體積

 

　　5、調(diào)節(jié)樣品的pH與流動相的一致。

 

四、流動相pH值對色譜分析的影響

 

      一般來說pH對于中性化合物幾乎沒有什么影響。這是因為一般情況下中性化合物不具備解離能力，因而不會對譜圖的分離選擇性及峰形的對稱性產(chǎn)生影響。對于含有極性官能團(tuán)的化合物來說，pH會影響化合物的存在狀態(tài)。進(jìn)而影響分離選擇性及色譜峰的對稱性。除此之外，一些做了改性或者M(jìn)ixed-Mode類型的色譜柱，即便分析物中不含有可電離的物質(zhì)，但是pH值會影響色譜柱上的官能團(tuán)狀態(tài)，進(jìn)而也會影響到中性化合物的分析。因此在進(jìn)行方法開發(fā)之前，首先要對所選的色譜柱及本身樣品所含成份的定性認(rèn)知。

 

      下圖展示的是不同pH對于中性非極性化合物、極性不可解離化合物以及極性可解離化合物的分離選擇性的影響。

 

 

 

      查閱文獻(xiàn)可以看出，當(dāng)水溶液的pH偏離化合物本身pKa 2個單位以上時，化合物主要以一種形態(tài)存在，而當(dāng)pH在化合物本身pKa 2個范圍以內(nèi)時，化合物以兩種形態(tài)存在(不解離與解離形態(tài))，而當(dāng)溶液的pH等于化合物本身的pKa的時候，化合物解離形態(tài)與不解離形態(tài)大約各占50%，如下圖所示。

 

 

       極性可解離化合物的容量因子與pH之間呈現(xiàn)S型曲線。對于堿性化合物而言，pH越大，其容量因子也越大；對于酸性化合物而言，pH越小，其容量因子也越大，這也是在使用反相HPLC“酸加酸，堿加堿”的原因，其目的在于抑制酸堿極性化合物的離子化作用，增強(qiáng)與C18固定相之間的相互作用，而提高該類化合物的保留時間。同時需要注意的是：在進(jìn)行方法開發(fā)的時候，盡量選取酸的高保留平臺去和堿的高保留平臺區(qū)，如果在中間斜率比較大區(qū)域，在pH值稍微有些變化的時候就會對峰形、保留時間、分離度有很大影響。

 

 

       pH的大小影響到極性可解離化合物以及色譜柱硅羥基的解離程度，離子化的分析物在典型的ODS反相色譜柱上往往會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。通過改變流動相的pH，抑制其解離，可改變極性可解離化合物的容量因子，改變其出峰位置，提高分離的選擇性，且提高色譜峰的對稱性。此外，有機(jī)相的添加會使得流動相的pH以及待分析化合物的pKa發(fā)生改變，因此在調(diào)節(jié)流動相pH的時候，最好將此部分也考慮進(jìn)去，在色譜柱的耐受范圍內(nèi)，盡可能地調(diào)節(jié)pH遠(yuǎn)離化合。