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本文主要介紹了杭州諾輝健康科技有限公司研發(fā)的醫(yī)療器械“幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）”的臨床前研發(fā)實(shí)驗(yàn)。

一、幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）的產(chǎn)品主要組成成分

本檢測(cè)試劑由試紙條、塑料件（管型）、取樣棒、樣本稀釋液組成；試紙上的主要成分有：包被用鼠抗 Hp 抗體、標(biāo)記用鼠抗Hp 抗體、鏈霉親和素、羊抗鼠 IgG、生物素、BSA、紅乳膠顆 粒、硝酸纖維素膜。 樣本稀釋液主要成分：乙二胺四乙酸四鈉水合物和氯化鈉。

二、幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）的產(chǎn)品預(yù)期用途

幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）用于體外定性檢測(cè)人糞便樣本中幽門(mén)螺桿菌抗原。本產(chǎn)品用于幽門(mén)螺桿菌感染的輔助診斷，既適用于專(zhuān)業(yè)醫(yī)務(wù)人員在醫(yī)療單位進(jìn)行幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)，也適用于消費(fèi)者自測(cè)，不建議用于幽門(mén)螺桿菌根除治療后人群進(jìn)行自測(cè)。 

三、幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）的產(chǎn)品包裝規(guī)格

管型：1 人份/盒；管型：2 人份/盒（1 人份/袋×2）；管型：5 人份/盒（1 人份/袋×5）

四、幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）的產(chǎn)品檢驗(yàn)原理

幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）采用雙抗體夾心法，試劑含有分別被事先固定于膜上檢測(cè)區(qū)（T）的鼠抗 Hp 抗體（VacA 抗原表位）和質(zhì)控區(qū)（C）的羊抗鼠 IgG 和鏈霉親和素，以及包被在聚酯膜上的乳膠標(biāo)記鼠抗 Hp 抗體和乳膠-BSA-生物素偶聯(lián)物。測(cè)試時(shí)，液體進(jìn)入檢測(cè)槽，隨之在毛細(xì)效應(yīng)下向上層析。 如樣本中含有 Hp 抗原，首先會(huì)和包被在聚酯膜上的乳膠標(biāo)記鼠抗 Hp 抗體形成抗原-抗體復(fù)合物，進(jìn)而通過(guò)檢測(cè)區(qū)（T）時(shí)會(huì)被固定在檢測(cè)區(qū)（T）鼠抗 Hp 抗體所捕獲，檢測(cè)區(qū)（T）會(huì)出現(xiàn)一條紅色條帶，判定為陽(yáng)性。如樣本中不含有 Hp 抗原，則檢測(cè)區(qū)（T）將不會(huì)形成雙抗夾心復(fù)合物，因此檢測(cè)區(qū)（T）內(nèi)將沒(méi)有紅色條帶出現(xiàn)，則判定為陰性。無(wú)論 Hp 抗原是否存在于樣本中，乳膠-BSA-生物素在層析過(guò)程中會(huì)被固定在膜上的鏈霉親和素結(jié)合，在質(zhì)控區(qū)（C）會(huì)出現(xiàn)一條紅色條帶。質(zhì)控區(qū)（C）內(nèi)所顯現(xiàn)的紅色條帶是判定層析過(guò)程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。 

五、幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）的主要原材料

1.主要原材料的選擇 

本產(chǎn)品的主要原材料包括：鼠抗幽門(mén)螺桿菌單克隆抗體、羊抗鼠IgG多克隆抗體、鏈霉親和素、紅乳膠顆粒、生物素、硝酸纖維素膜，這些原材料均是通過(guò)外購(gòu)的方式獲得。 

諾輝健康對(duì)主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。 

2.企業(yè)參考品設(shè)置情況

諾輝健康設(shè)計(jì)了完整的企業(yè)參考品，包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、精密度參考品和最低檢測(cè)限參考品。 

企業(yè)參考品由菌液和臨床陰性樣本制備而成。陽(yáng)性參考品12份，由6種不同來(lái)源的幽門(mén)螺桿菌組成，包括不同濃度水平。陰性參考品20份，包括10份特異性菌株和10份臨床陰性樣本。 

精密度參考品18份，由6種不同來(lái)源的幽門(mén)螺桿菌組成，包括陰性、弱陽(yáng)性和中等陽(yáng)性水平。最低檢測(cè)限參考品6份，由6種不同來(lái)源的幽門(mén)螺桿菌組成。

六、幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究 

諾輝健康通過(guò)對(duì)試劑主要生產(chǎn)工藝的研究，確定最佳的生產(chǎn)工藝。對(duì)試劑反應(yīng)體系研究包含樣本稀釋液裝載量、膜條寬度、參與反應(yīng)的液體量、不同溫濕度條件下的檢測(cè)時(shí)間和判讀時(shí)間、 加樣量、樣本混勻方式等，通過(guò)一系列研究，最終確定了最佳 的反應(yīng)體系。 

七、幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）的分析性能評(píng)估研究

本產(chǎn)品分析性能評(píng)估內(nèi)容包括準(zhǔn)確度、精密度、分析靈敏度、鉤狀效應(yīng)、分析特異性（交叉和干擾）的研究，同時(shí)對(duì)水樣便樣本類(lèi)型的適用性和糞便樣本穩(wěn)定性也進(jìn)行了研究。申請(qǐng)人提交了有效運(yùn)行的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)的三批產(chǎn)品性能評(píng)估資料。 

在準(zhǔn)確度性能評(píng)估中，諾輝健康使用陰性參考品、陽(yáng)性參考品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果陽(yáng)性符合率和陰性符合率均為 100%。使用不同地域臨床菌株和臨床陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性檢出率為 100%。 

在精密度性能評(píng)估中，諾輝健康使用精密度參考品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示精密度陰性參考品陰性檢出率為 100%，精密度弱陽(yáng)性參考品陽(yáng)性檢出率＞95%，精密度中等陽(yáng)性參考品陽(yáng)性檢出率為 100%。使用精密度參考品（包括精密度陰性參考品 1 份，精密度弱陽(yáng)性參考品 6 份，精密度陽(yáng)性參考品 1 份），由四位實(shí)驗(yàn) 

人員在三個(gè)實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)進(jìn)行 20 天的檢測(cè)，同時(shí)評(píng)估了日內(nèi)、日間、人員間、批內(nèi)、批間和地點(diǎn)間精密度，結(jié)果顯示檢測(cè)結(jié)果符合精密度性能要求，且色帶顯色強(qiáng)度差異均≤1 個(gè)檔次色差。 

在分析靈敏度性能評(píng)估中，進(jìn)行了最低檢測(cè)限的確定和驗(yàn)證。通過(guò)對(duì) 7 種不同來(lái)源幽門(mén)螺桿菌配制成不同濃度的菌液，每個(gè)濃度檢測(cè) 20 次，確定陽(yáng)性檢出率≥95%的最低濃度水平作為最低檢測(cè)限，結(jié)果顯示檢測(cè) 7 種幽門(mén)螺桿菌時(shí)，最低檢出限濃度都為 3×104 CFU/mL。采用三批試劑盒對(duì)最低檢測(cè)限水平不同來(lái)源菌液分別重復(fù)檢測(cè) 20 次，檢測(cè)結(jié)果顯示其陽(yáng)性檢出率都≥95%。采用三批試劑盒對(duì)于最低檢出限蛋白量進(jìn)行研究，結(jié)果表明檢測(cè)與抗體對(duì)應(yīng)表位的抗原蛋白最低檢出限為 125 ng/mL。 

在交叉反應(yīng)的性能評(píng)估中，諾輝健康采用 14 份濃度不高于1×107CFU/mL 的特異性菌株（普通變形桿菌、空腸彎曲菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌、乙酸鈣不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形菌、福氏志賀菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌）分別對(duì)三批試劑盒的特異性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陰性符合率均為100%，本產(chǎn)品與濃度不高于 1×107CFU/mL 的 14 份菌株不發(fā)生交叉反應(yīng)。 

在干擾物質(zhì)的性能評(píng)估中，使用 11 份不同濃度的干擾物質(zhì)（抗壞血酸、脂肪、膽紅素、雷尼替丁、奧美拉唑、粘液素、氫氧化鈉鋁、白細(xì)胞、法莫替丁、血紅蛋白和枸櫞酸鉍鉀），分別對(duì)三批試劑盒的干擾濃度進(jìn)行研究，結(jié)果顯示當(dāng)抗壞血酸＜20mg/dL、粘液素＜2000mg/dL、脂肪＜500mg/mL、氫氧化鈉鋁＜20mg/g、膽紅素＜60mg/dL、白細(xì)胞＜10000 個(gè)/ mL、雷尼替丁＜2mg/g、法莫替?。?mg/g、奧美拉唑＜2mg/g、血紅蛋白＜20mg/g、枸櫞酸鉍鉀＜3mg/g（相當(dāng)于 1.1 mg/g 鉍）時(shí)，干擾物質(zhì)對(duì)試劑盒檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響。 在鉤狀效應(yīng)性能評(píng)估中，諾輝健康采用幽門(mén)螺桿菌菌懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)總€(gè)梯度的稀釋液重復(fù) 3 次，繪制鉤狀效應(yīng)曲線圖，產(chǎn)品信號(hào)強(qiáng)度隨著幽門(mén)螺旋桿菌濃度的先升高后平穩(wěn)，在平穩(wěn) 

期隨著幽門(mén)螺桿菌濃度的升高卻未發(fā)現(xiàn)信號(hào)強(qiáng)度下降的現(xiàn)象，1×108CFU/mL 幽門(mén)螺桿菌濃度是臨床上細(xì)菌感染水平（106CFU/mL）的 100 倍時(shí)，產(chǎn)品仍未發(fā)生鉤狀效應(yīng)。結(jié)果表明在幽門(mén)螺桿菌濃度≤1×108 CFU/mL 時(shí)不會(huì)因?yàn)楫a(chǎn)生鉤狀效應(yīng)而影響本產(chǎn)品的檢測(cè)性能，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。諾輝健康對(duì)糞便樣本的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明糞便樣本常溫可保存 6 小時(shí)；2～8℃下可保存 72 小時(shí)；-25～-15℃冷凍儲(chǔ)存可保存 6 個(gè)月，樣本最多能反復(fù)凍融 3 次。 

諾輝健康使用一批次試劑對(duì)水樣便的適用性進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水樣便類(lèi)型樣本對(duì)本產(chǎn)品的檢測(cè)性能無(wú)影響。 

八、幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）的陽(yáng)性判斷值研究

諾輝健康使用臨床上診斷明確的 200 例糞便樣本（尿素呼氣試驗(yàn)（UBT）陽(yáng)性 94 例、陰性 106 例）對(duì)陽(yáng)性判斷值進(jìn)行研究，通過(guò)臨界值研究確定本試劑臨界值為 3×104 CFU/mL。研究結(jié)果 顯示，申報(bào)產(chǎn)品與 UBT 結(jié)果比對(duì)，靈敏度為96.8%，特異性為97.2%，總符合率為 97.0%，Kappa 值為 0.92。使用本試劑盒和已上市同類(lèi)產(chǎn)品同時(shí)對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明本試劑與對(duì)比試劑和UBT 檢測(cè)結(jié)果顯示了高度的一致性。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證確定陽(yáng)性判斷值為 3×104 CFU/mL。 

九、幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)試劑（乳膠法）的穩(wěn)定性研究

諾輝健康對(duì)本產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究包括貨架效期穩(wěn)定性、開(kāi)封穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性，確定了各種條件下本產(chǎn)品的有效保存時(shí)間，所用試劑批號(hào)為 201804001、201804002、201805001。 貨架效期穩(wěn)定性：采用三批試劑進(jìn)行研究，試劑保存在 2～ 30℃條件下，分別于保存第 0 個(gè)月、3 個(gè)月、6 個(gè)月、9 個(gè)月、 12 個(gè)月、13 個(gè)月時(shí)取出試劑盒，對(duì)試劑盒的陰陽(yáng)符合率、精密度、最低檢測(cè)限進(jìn)行考察，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求，但在 19～30℃條件下實(shí)際保存 250 天，綜合考慮，確定產(chǎn)品在 2～25℃儲(chǔ)存條件下，可穩(wěn)定保存 8 個(gè)月。 

開(kāi)封穩(wěn)定性：隨機(jī)抽取三批試劑，設(shè)置恒溫恒濕箱的溫度為 30℃、濕度為 90%，打開(kāi)試劑鋁箔袋，放入恒溫恒濕箱保存分別在鋁箔袋打開(kāi) 1h 和 1.5h 時(shí)取出，對(duì)試劑盒的陰陽(yáng)符合率、精密度、最低檢測(cè)限進(jìn)行考察，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求，確定試劑盒鋁箔袋打開(kāi)后，在溫度 15～30℃、濕度 20%～90%的 環(huán)境下，可保存 1 個(gè)小時(shí)。