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我們在進行一個方法驗證時，最好也必須準備一個方案，按照此方案進行相關實驗，避免臨時進行實驗設計造成不必要的錯誤。此文將探討一下有關物質驗證的方案設計。

 

有關物質驗證一般包括專屬性、定量限（如果檢測限滿足報告閾值，按照ICH可以不進行檢測限的驗證）、線性和范圍、方法精密度、準確度、中間精密度、耐用性（包括濾膜研究）和溶液穩(wěn)定性。每一個驗證實驗均應滿足系統(tǒng)適應性的要求。

 

不管是國內(nèi)還是國外，產(chǎn)品有時有多個規(guī)格，所有規(guī)格都需要進行方法驗證嗎？答案是否定的，那么選用什么規(guī)格進行方法驗證呢？例如，有X（小規(guī)格）、Y（中間規(guī)格）、Z（大規(guī)格）三個規(guī)格，一般三個規(guī)格最終供試品溶液濃度一致，建議按如下情況：

 

▍1. 當X、Y、Z為等比例處方

 

a．供試品溶液配制：稱取相當于一定量（如100mg）的活性成分，則選用任一規(guī)格均可，一般選擇最大Z或最小規(guī)格X。

 

b．供試品溶液配制：轉移一定量的片（如5片或10片）至同一規(guī)格容量瓶，則選用最大規(guī)格Z；如果轉移至不同規(guī)格容量瓶，母液濃度一致，則同1a。

 

▍2. 當X、Y、Z為等片重

 

a．供試品溶液配制：稱取相當于一定量（如100mg）的活性成分，則選用最小規(guī)格（輔料最多）。

 

b．供試品溶液配制：轉移一定量的片（如5片或10片）至同一規(guī)格容量瓶，則選用最大規(guī)格（原料藥最多，考慮API/雜質溶解性的影響）；如果轉移至不同規(guī)格容量瓶，母液/最終濃度一致，則選用最小規(guī)格。

 

▍3. 當X與Y等比例處方，X與Z等片重

 

a．供試品溶液配制：稱取相當于一定量（如100mg）的活性成分，對于X和Y規(guī)格，則選用任一規(guī)格均可；對于X和Z規(guī)格，同2a，則選用小規(guī)格X。因此，選用X規(guī)格。

 

b．供試品溶液配制：轉移一定量的片（如5片或10片）至同一規(guī)格容量瓶，對于X和Y規(guī)格，選用大規(guī)格Y；對于X和Z規(guī)格，則選用最大規(guī)格Z，最終應該根據(jù)API溶解性和輔料影響選擇。如果轉移至不同規(guī)格容量瓶，母液濃度一致，對于X和Y規(guī)格，選用任一規(guī)格；對于X和Z規(guī)格，則選用最小規(guī)格X。因此，選用小規(guī)格X。

 

對于X、Y、Z的關系基本為以上關系，即使關系稍有不同也可參考上述進行規(guī)格選擇。當然如果有更多規(guī)格時，且有些規(guī)格處方之間相似性較小時，選擇2個規(guī)格進行方案驗證有時也是必要的。

 

我們以主成分外標法為例，雜質限度假設如下表：

 

 

1.0溶液配制

 

a．供試品溶液：取20片稱重，研磨均勻，精密稱取相當于100mg 活性成分的粉末置于100mL容量瓶，加入稀釋溶解，并定容至刻度，搖勻（如有必要需要超聲）。（1mg/mL）

 

b．標準品溶液：精密稱取20mg主成分標準品置于100mL容量瓶，加入稀釋劑定容至刻度，搖勻。精密移取上述溶液5.0mL置于200mL容量瓶，加入稀釋劑定容至刻度，搖勻。（5μg/mL）

 

c．建議配制靈敏度溶液：以報告閾值計算濃度，一般為0.05%或0.1%的供試品溶液。

 

2.0驗證項目

 

系統(tǒng)適用性

 

專屬性

 

定量限

 

線性和范圍

 

精密度

 

準確度

 

中間精密度

 

耐用性

 

溶液穩(wěn)定性

 

2.1系統(tǒng)適用性

 

序列設置

 

1針空白稀釋劑（系統(tǒng)穩(wěn)定后）；

 

1針靈敏度溶液；

 

5針或6針標準品溶液Std

 

1針各供試品溶液

 

1針標準品溶液（每12小時或序列結束插入Std）

 

滿足分離度、理論板數(shù)、拖尾因子、信噪比等要求；

 

滿足5針或6針標準品溶液中主峰峰面積RSD的要求，滿足序列中或末尾插入標準品溶液峰面積與前5針或6針主峰峰面積RSD的要求。

 

2.2 專屬性

 

（1）空白溶劑、空白輔料和雜質干擾

 

按1.0溶液配制 配制空白溶劑、標準品溶液、供試品溶液。

 

空白輔料：精密稱取相當于100mg活性成分的空白輔料粉末（如果不同規(guī)格，包衣粉不一致，各規(guī)格都需分別配制空白輔料）。

 

雜質A標準品儲備溶液：精密稱量10mg雜質A標準品置于200mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。（50μg/mL）

 

雜質B標準品儲備溶液：精密稱量10mg雜質B標準品置于100mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。精密移取上述溶液10.0mL置于50mL容量瓶，加入稀釋劑定容至刻度，搖勻。（20μg/mL）

 

混合溶液：精密稱取相當于100mg 活性成分的粉末置于100mL容量瓶，分別移取上述雜質標準品儲備溶液10.0mL，加入稀釋溶解并定容至刻度（如有必要需要超聲）。

 

序列設置：

 

?1針空白稀釋劑（系統(tǒng)穩(wěn)定后）；

 

?1針靈敏度溶液；

 

? 5針或6針標準品溶液Std

 

? 雜質A標準品儲備溶液

 

? 雜質B標準品儲備溶液

 

? 1針混合溶液

 

? 1針標準品溶液（每12小時或序列結束插入Std）

 

接受標準：

 

a．空白溶劑和空白輔料對主成分、雜質A和雜質B無干擾；

 

b．混合溶液中，主成分、雜質A和雜質B峰與相鄰雜質峰之間的分離度大于1.5。采用PDA/DAD檢測器，主成分、雜質A和雜質B峰峰純度角小于純度閾值，或峰純度因子大于995。

 

（2）強降解實驗

 

注：（1）選用PDA/DAD檢測器，選用200nm-400nm波長。

 

（2）一般至少有一個破壞條件產(chǎn)生雜質的量在5-20%，如果降解條件比較劇烈使大部分原料發(fā)生降解，應采用溫和條件或縮短時間再進行試驗；如果最劇烈的條件下，降解的雜質量仍小于5%，說明活性成分比較穩(wěn)定，無需采用更劇烈的條件。

 

溶液破壞：

 

? 未破壞條件樣品

 

? 加熱條件破壞樣品：一般溶液60℃水浴加熱

 

? 酸性條件破壞樣品：一般采用0.1mol/L-1.0mol/L鹽酸

 

? 堿性條件破壞樣品：一般采用0.1mol/L-1.0mol/L氫氧化鈉

 

? 氧化條件破壞樣品：一般采用0.1%-3%過氧化氫，中性條件下破壞7天。

 

? 光照射條件破壞樣品：至少照射1.2×106 Lux*h，紫外能量不低于200w*h/m2

 

固體破壞：

 

?高溫高濕條件破壞樣品：建議50-60℃（高于加速試驗溫度10℃），相對濕度75%或更高。

 

? 光照條件破壞樣品：至少照射1.2×106 Lux*h

 

 對于國內(nèi)申報，可以不做固體破壞（因有影響因素試驗5天/10天）

 

接受標準：

 

a．破壞樣品溶液和未破壞樣品溶液中，主成分與相鄰雜質峰之間的分離度大于1.5。采用PDA/DAD檢測器，主成分峰純度角小于純度閾值，或峰純度因子大于995。

 

b．物料平衡在90%-110%，如果不平衡給出合理的解釋。

 

2.3 定量限

 

以報告閾值或小于報告閾值作為定量限，根據(jù)ICH日劑量大于1g，報告閾值為0.05%；日劑量小于等于1g，報告閾值為0.1%。當定量限大于報告閾值時，一般可認為方法的靈敏度較低，但如果雜質限度遠大于報告閾值，小編認為也可以接受。

 

接受標準：

 

a．6針定量限溶液的相對標準偏差（RSD）不得過15%；

 

b．主成分、雜質A和雜質B的信噪比不小于10。

 

2.4 線性和范圍

 

雜質A溶液：精密稱量12.5mg雜質A標準品置于50mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。（250μg/mL）

 

雜質B溶液：精密稱量10mg雜質B標準品置于100mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。（100μg/mL）

 

主成分工作標準品溶液：精密稱量12.5mg主成分標準品置于50mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。（250μg/mL）

 

線性儲備溶液：分別取上述溶液各10.0mL至50mL容量瓶中，稀釋劑定容至刻度，搖勻。

 

LOQ儲備溶液：分別取上述雜質A溶液和主成分溶液各1.0mL，雜質B溶液2.5mL至50mL容量瓶中，稀釋劑定容至刻度，搖勻。

 

一般配制從定量限至120%或150%限度濃度的溶液。按照下表進行線性溶液制備。

 

接受標準： 相關系數(shù)大于0.9900。

 

 

2.5 精密度

 

制備6份供試品溶液，如果供試品溶液中雜質A或雜質B含量小于報告閾值，需制備6份100%添加樣品溶液，考察方法的精密度。

 

接受標準：雜質A、雜質B、最大未知雜質（大于報告閾值）和總雜質的相對標準偏差滿足下表。

 

 

2.6 回收率

 

制備3個水平準確度溶液，分別為LOQ×3，100%×3和120%×3。通過樣品粉末或輔料空白中添加一定量的雜質標準品溶液或主成分標準品溶液，考察方法的準確度。

 

（1）已知雜質準確度

 

使用2.4線性和范圍項下LOQ儲備溶液和線性儲備溶液，精密稱取相當于100mg 活性成分的粉末置于100mL容量瓶，按下表加入相應量的標準品溶液，其他同供試品溶液處理。

 

接受標準：

 

a.    雜質A回收率在90%-110%范圍內(nèi)，相對標準偏差不得過10%。

 

b.    雜質B回收率在80%-120%范圍內(nèi)，相對標準偏差不得過10%。

 

 

（2）  未知雜質準確度

 

主成分標準品溶液：精密稱量10mg活性成分標準品置于50mL容量瓶，加入稀釋劑溶解并定容，搖勻。精密移取上述溶液10.0mL置于100mL容量瓶，加入稀釋劑定容至刻度，搖勻。（20μg/mL）

 

精密稱取相當于100mg 活性成分的空白輔料粉末置于100mL容量瓶，按下表加入相應量的標準品溶液，其他同供試品溶液處理。

 

接受標準：活性成分回收率在80%-120%范圍內(nèi)，相對標準偏差不得過10%。

 

 

2.7 中間精密度

 

由第二個實驗者在不同天采用不同的色譜柱、不同液相色譜等，采用同一批號的樣品進行中間精密度實驗。

 

制備6份供試品溶液，如果供試品溶液中雜質A或雜質B含量小于報告閾值，需制備6份100%添加樣品溶液，考察方法的中間精密度。

 

接受標準：

 

a．雜質A、雜質B、最大未知雜質（大于報告閾值）和總雜質的相對標準偏差滿足2.5項下表格。

 

b．兩個分析者測定雜質A、雜質B和最大未知雜質（大于報告閾值）相對偏差滿足下表。

 

 

2.8 耐用性

 

（1） 通過變動色譜柱、柱溫、流速、緩沖鹽pH和有機相比例等考察方法的耐用性。

 

（2）根據(jù)稀釋劑的性質，選擇至少兩種濾膜考察不同濾膜的影響，收集第1mL、2mL、3mL、4mL和5mL，如果還不滿足標準，需繼續(xù)進行。

 

 

制備標準品溶液和供試品溶液，如果供試品溶液中雜質A或雜質B含量小于報告閾值， 需采用100%添加樣品溶液代替供試品溶液，考察方法的耐用性。

 

接受標準：

 

a．滿足系統(tǒng)適用性要求。

 

b．各條件下測定雜質A、雜質B和最大未知雜質（大于報告閾值）與正常條件下結果的偏差滿足下表。

 

 

2.9 溶液穩(wěn)定性

 

配制標準品溶液和供試品溶液（如果雜質A或雜質B含量小于報告閾值，建議采用100%添加溶液）在室溫和冷藏條件下在0h、12h、24h和48h考察樣品溶液的穩(wěn)定性。

 

接受標準：各時間下測定雜質A、雜質B和最大未知雜質（大于報告閾值）與正常條件下結果的偏差滿足下表。

 

 

3.0結語

 

此方案設計的觀點不代表官方觀點。本文是小編根據(jù)ANDA項目研發(fā)經(jīng)驗和多個產(chǎn)品FDA回復意見總結設計。