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 摘  要 

 

介紹原料藥(active pharmaceutical ingredient，API)中基因毒性雜質(zhì)控制的法規(guī)要求、評(píng)估方法和控制方法。方法 通過(guò)學(xué)習(xí)歐美法規(guī)發(fā)展歷史，理解國(guó)際高端市場(chǎng)對(duì)基因毒性雜質(zhì)控制的監(jiān)管期望，提出原料藥中基因毒性雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法。結(jié)果與結(jié)論 企業(yè)基于半定量評(píng)估，結(jié)合清除研究數(shù)據(jù)，建立科學(xué)的控制策略，使實(shí)際工藝中所有可能涉及的基因毒性雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)得到明確鑒別和控制，是達(dá)到監(jiān)管期望的有效途徑。

基因毒性物質(zhì)是指能直接或間接損害DNA，導(dǎo)致基因突變或癌癥的物質(zhì)?；蚨拘晕镔|(zhì)對(duì)DNA 的損害作用包括染色體斷裂、DNA 重組、DNA 復(fù)制過(guò)程中共價(jià)鍵結(jié)合或插入，也包括通過(guò)激活細(xì)胞產(chǎn)生基因毒性物質(zhì)而產(chǎn)生的突變。

隨著基因毒性雜質(zhì)法規(guī)逐步健全，藥政官方對(duì)基因毒性雜質(zhì)的監(jiān)管要求越來(lái)越高。近些年，在產(chǎn)品的上市申請(qǐng)中，由于基因毒性雜質(zhì)控制不合規(guī)而導(dǎo)致的缺陷越來(lái)越多。充分的基因毒性雜質(zhì)研究已經(jīng)成為產(chǎn)品能否上市的關(guān)鍵。本研究通過(guò)考察法規(guī)形成的歷史事件和演變過(guò)程，深入理解目前監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)基因毒性雜質(zhì)的立場(chǎng)，并針對(duì)企業(yè)現(xiàn)狀，提出原料藥(active pharmaceutical ingredient，API)中基因毒性雜質(zhì)評(píng)估和控制的建議。

 

1、法規(guī)研究年

 

1.1 歐洲對(duì)基因毒性雜質(zhì)的監(jiān)管

 

2000 年，歐洲監(jiān)管機(jī)構(gòu)率先開始關(guān)注基因毒性雜質(zhì)，PharmEuropa 發(fā)表了一篇文章，提到注意在成鹽工藝中，磺酸在乙醇溶液中形成磺酸酯的潛在風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)時(shí)，該刊物僅要求“進(jìn)一步信息”來(lái)理解該物質(zhì)形成的風(fēng)險(xiǎn)，包括評(píng)估檢測(cè)方法和安全指標(biāo)的設(shè)立。這個(gè)事件被視為具有里程碑意義，標(biāo)志著專注于基因毒性雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和控制的一個(gè)新時(shí)代。

2002 年12 月，代表EMEA 安全工作組(SafetyWorking Party，SWP)的專利藥物委員會(huì)(Committee for Proprietary Medicinal Products，CPMP；現(xiàn)為人用藥物委員會(huì)Committee for Human MedicinalProducts，CHMP)發(fā)布了一份關(guān)于基因毒性雜質(zhì)的意見(jiàn)書。指南中將基因毒性雜質(zhì)的限度分為兩類：①有足夠證據(jù)來(lái)支持閾值機(jī)制的基因毒性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)存在一個(gè)清晰可辨的限度，低于該限度，則不能觀察到顯著的毒理作用，因此，可以采用ICH Q3C(R5)中二類溶劑的方法進(jìn)行控制；②沒(méi)有充分閾值機(jī)制證據(jù)的基因毒性雜質(zhì)。這些雜質(zhì)應(yīng)當(dāng)采用“最低技術(shù)可行”(as low astechnically feasible，ALATF)的原則進(jìn)行控制。

雖然這種方法在大部分案例中均被接受，但是缺乏閾值評(píng)估的數(shù)據(jù)。因此，在2004 年發(fā)布的基因毒性雜質(zhì)限度指南(草案)中，對(duì)意見(jiàn)書進(jìn)行了重大修改。草案采用“最低合理可行”(as low as reasonably practical，ALARP)代替ALATF，默許全面消除風(fēng)險(xiǎn)的概念是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，因此建議采用毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicologicalconcern，TTC)限度(1.5 μg·d?1)[4]作為基因毒性雜質(zhì)的可接受限度。具體含義為在人的一生(70 歲)中，每天攝入1.5 μg 基因毒性雜質(zhì)，其致癌的風(fēng)險(xiǎn)是可接受的(<1/100 000)?；蚨拘噪s質(zhì)可接受限度(ppm)=TTC 限度(μg·d-1)/ 藥物的最大日劑量(g·d-1)。

TTC 推算條件如下：通過(guò)最敏感物種和最敏感部位數(shù)據(jù)，建立50%腫瘤發(fā)生率劑量TD50；從含有730 種致癌物的數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選一子類，此數(shù)據(jù)庫(kù)能夠充分估計(jì)口服劑量的TD50；從TD50 到10-6 簡(jiǎn)單線性外推；假定在高劑量時(shí)產(chǎn)生腫瘤的所有生物學(xué)過(guò)程外推500 000 倍時(shí)均呈線性；未考慮細(xì)胞保護(hù)、DNA 修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期控制過(guò)程的可能性影響；假定無(wú)劑量響應(yīng)閾值，對(duì)所有的化合物進(jìn)行分析。

因此，TTC 是一個(gè)非常保守的限度。TTC 概念的應(yīng)用允許在無(wú)任何體內(nèi)數(shù)據(jù)時(shí)，在足夠的安全性基礎(chǔ)上建立雜質(zhì)控制限度。TTC 概念的應(yīng)用有利于患者、企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)，使他們避免做不必要的毒理研究和安全性評(píng)估。然而，該草案沒(méi)有明確短期臨床實(shí)驗(yàn)中的容許限度，使得在某些短期臨床研究中，也被迫接受1.5 μg·d-1 的終生暴露限值。因此，在行業(yè)發(fā)展的要求下，“階段化”TTC 概念也應(yīng)運(yùn)而生。

美國(guó)藥物研究和制造商協(xié)會(huì)(PharmaceuticalResearch and Manufacturers of America，PhRMA)由Lutz Mueller 領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)專家小組，于2006 年1 月PhRMA 發(fā)布白皮書，開發(fā)了一套基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)、分類、界定和獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的程序。根據(jù)積累劑量定義暴露風(fēng)險(xiǎn)的原則，提出了階段化TTC 概念，詳見(jiàn)表1。

 

 

值得注意的是該方法在計(jì)算暴露時(shí)間在12 個(gè)月以下的情況時(shí)，采用1/1 000 000 的風(fēng)險(xiǎn)概率來(lái)代替標(biāo)準(zhǔn)TTC 相關(guān)的終生暴露的1/100 000 概率。此外，白皮書還將基因毒性雜質(zhì)分為5 類，見(jiàn)表2。

 

 

2006 年6 月，EMEA 頒發(fā)了關(guān)于基因毒性雜質(zhì)限度指南的最終版[7]，并在2008 年由CHMP 安全工作組(CHMP Safety Working Party, SWP)發(fā)布Q&A[8]，對(duì)指南中的一些問(wèn)題進(jìn)行了澄清和確認(rèn)。這些澄清和確認(rèn)為業(yè)界提供了非常重要并具有可行性的指南，表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

①階段化TTC 限度。SWP 明確臨床研究中持續(xù)調(diào)整TTC 限度是可接受的，并且對(duì)Lutz Mueller提出的階段化TTC 限度進(jìn)行修改，詳見(jiàn)表3。

 

 

SWP 聲明這些限度僅適用于臨床研究階段，而不能機(jī)械地用于短期使用的市售產(chǎn)品。但對(duì)于急用于治療的申請(qǐng)，考慮到產(chǎn)品的特定風(fēng)險(xiǎn)和收益，可在其上市申請(qǐng)中提出此類控制限度，在審查過(guò)程中，再建立批準(zhǔn)市售產(chǎn)品的特定產(chǎn)品限度。

②指南對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)品的適用性。對(duì)于現(xiàn)有產(chǎn)品是否需要重新評(píng)估基因毒性雜質(zhì)的問(wèn)題，EDQM通過(guò)藥典出版物討論了藥典專論的適用性，聲明：“已徹底評(píng)估了包括在近年來(lái)授權(quán)的藥品中的物質(zhì)的安全性，并鑒于他們使用的經(jīng)驗(yàn)，需要追溯調(diào)整基因毒性雜質(zhì)的政策被認(rèn)為是不需要的，除非有具體關(guān)注的原因”。歐洲藥典委員會(huì)認(rèn)為一個(gè)產(chǎn)品在接受市場(chǎng)監(jiān)管的時(shí)候應(yīng)該對(duì)可能存在的基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)估，這是建立一個(gè)新產(chǎn)品各論的基本要求。歐洲藥典在建立或修訂藥典各論的時(shí)候，要求提供現(xiàn)實(shí)可行的基因毒性雜質(zhì)控制途徑，詳見(jiàn)表4。

 

 

③多個(gè)基因毒性雜質(zhì)的控制。SWP 聲明：當(dāng)多個(gè)基因毒性雜質(zhì)存在于原料藥中時(shí)，只要雜質(zhì)結(jié)構(gòu)(指警示結(jié)構(gòu))不相關(guān)，1.5 μg·d-1 的TTC 限度可應(yīng)用于單個(gè)雜質(zhì)。

④避免使用和ALARP。SWP 通過(guò)Q&A 文件確認(rèn)，如果已證明產(chǎn)品或物質(zhì)可控，則無(wú)需進(jìn)行額外的工作以進(jìn)一步降低基因毒性雜質(zhì)的水平。也就是說(shuō)，只要保證產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性可接受，并不需要完全避免在工藝中使用基因毒性物質(zhì)，因此，在工藝中控制和不回避是產(chǎn)品和工藝開發(fā)的基本要求。

⑤ICH 鑒定限度和基因毒性雜質(zhì)評(píng)估的關(guān)系。關(guān)于怎樣將ICH 鑒定限度與未知雜質(zhì)聯(lián)系起來(lái)，怎樣將鑒定限度和基因毒性雜質(zhì)評(píng)估聯(lián)系起來(lái)的問(wèn)題，SWP 提供的答案是確認(rèn)ICH Q3a 概述的鑒定限度仍然是適宜的，主要是因?yàn)樵纤幍目傮w質(zhì)量已經(jīng)在工藝路線上有明確合理的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估支持，這有助于鑒別顯著潛在的主要風(fēng)險(xiǎn)。該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可以保證原料藥的質(zhì)量，并意味著那些低于鑒別限的未知雜質(zhì)不太可能具有潛在基因毒性。

在基因毒性雜質(zhì)情況未知時(shí)，可以參考ICHQ3a 的鑒定限度對(duì)產(chǎn)品建立有關(guān)物質(zhì)指標(biāo)。但也需要對(duì)所有雜質(zhì)進(jìn)行基因毒性評(píng)估，評(píng)估結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒(méi)有基因毒性雜質(zhì)或者所有基因毒性雜質(zhì)都已經(jīng)被清除，則不需要在產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加基因毒性雜質(zhì)的限度，而只采用一般雜質(zhì)的有關(guān)物質(zhì)指標(biāo)即可。

 

1.2 美國(guó)FDA 對(duì)基因毒性雜質(zhì)的監(jiān)管

 

EMEA指南和隨后的Q&A在技術(shù)上僅適用于歐洲。FDA 雖然在口頭上表示支持EMEA 的基本原則，但直到2008 年底，F(xiàn)DA 的立場(chǎng)仍比較模糊。在2008 年12 月，F(xiàn)DA 終于公布了他們期待已久的基因毒性雜質(zhì)主題的指南草案。

不出所料，F(xiàn)DA 指南草案和EMEA 指南在關(guān)鍵原則方面保留大部分相似，如認(rèn)可階段化TTC限度和使用SAR 評(píng)估方法。不過(guò)也存在一些顯著差異，例如FDA 建議引入不同患者群的下限，特別是兒童群；對(duì)于任何高于ICH 鑒定限度的雜質(zhì)，不論其是否具有警示結(jié)構(gòu)，均應(yīng)對(duì)分離的雜質(zhì)進(jìn)行特定的基因毒性測(cè)試；對(duì)于EMEA 在Q&A 中修改的避免和ALARP，F(xiàn)DA 并不采納，而是直接套用EU 指南；在階段化TTC 應(yīng)用中，F(xiàn)DA 支持延長(zhǎng)120 μg·d?1 的限度應(yīng)用到非常短(不到14 d)的研究中，等等。

ICH 對(duì)基因毒性雜質(zhì)的行動(dòng)：同時(shí)滿足歐美兩個(gè)不同的指南，對(duì)企業(yè)來(lái)說(shuō)是個(gè)挑戰(zhàn)。因此ICH正著手修訂關(guān)于基因毒性雜質(zhì)的指南M7，并于2013 年2 月6 日發(fā)布了第二階段征求意見(jiàn)稿，其中對(duì)階段化TTC 及API 中GTIs 的控制方法均進(jìn)行了定義，同時(shí)，也提出了對(duì)工藝中涉及的基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的4 種控制策略，指出需要對(duì)原料藥工藝中涉及的基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行科學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，包括對(duì)影響雜質(zhì)命運(yùn)的各種因素進(jìn)行評(píng)估，包括化學(xué)活性、溶解性、揮發(fā)性、電離性及其他物理操作步驟對(duì)雜質(zhì)去除的影響等。

 

2.原料藥中基因毒性雜質(zhì)的評(píng)估

 

2.1 原料藥企業(yè)對(duì)基因毒性雜質(zhì)的研究現(xiàn)狀

 

隨著監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)合成類藥物中基因毒性雜質(zhì)的控制期望不斷提高，制藥企業(yè)越來(lái)越多地收到基因毒性雜質(zhì)研究不足的缺陷信。EDQM 自2006年以來(lái)每年都發(fā)布上一年度申報(bào)資料中存在的十大常見(jiàn)缺陷問(wèn)題報(bào)告[11]。作為基因毒性雜質(zhì)監(jiān)管的倡導(dǎo)者，EDQM 在其歷年匯總的TOP10 缺陷條款中，多次提到基因毒性雜質(zhì)研究不足的缺陷，從最近2011 年的前三大缺陷條款中可以看出，基因毒性雜質(zhì)的控制不充分是首當(dāng)其沖的問(wèn)題，見(jiàn)表5。因此，為了新產(chǎn)品成功上市，制藥企業(yè)必須先解決產(chǎn)品中基因毒性雜質(zhì)的控制問(wèn)題。

 

 

可見(jiàn)，基因毒性雜質(zhì)的監(jiān)管已經(jīng)是歐洲申報(bào)文件審評(píng)的重中之重，同時(shí)也反映出，原料藥企業(yè)在申報(bào)產(chǎn)品前，對(duì)基因毒性雜質(zhì)的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。具體表現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：

①對(duì)工藝路線中所涉及的基因毒性雜質(zhì)來(lái)源評(píng)估不全面。沒(méi)有全面考慮起始物質(zhì)、試劑、溶劑等可能帶入的基因毒性物質(zhì)，對(duì)工藝過(guò)程中可能產(chǎn)生的基因毒性雜質(zhì)也沒(méi)有充分評(píng)估。

②對(duì)基因毒性雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和毒性評(píng)估不充分。表現(xiàn)為將基因毒性雜質(zhì)等同于一般雜質(zhì)，在建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，沒(méi)有充分評(píng)估雜質(zhì)是否具有基因毒性或致癌性。

③對(duì)基因毒性雜質(zhì)的控制不充分。表現(xiàn)為在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中按單個(gè)未知雜質(zhì)處理，控制在0.10%限度以下；或者在連續(xù)3 批原料藥產(chǎn)品中檢測(cè)基因毒性雜質(zhì)，得到檢測(cè)結(jié)果<30% TTC 限度，即認(rèn)為產(chǎn)品中不存在基因毒性雜質(zhì)，而取消產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的常規(guī)檢測(cè)等。

④充分的基因毒性雜質(zhì)研究需要克服以上缺陷，從基因毒性雜質(zhì)的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、分類等方面進(jìn)行評(píng)估，確定工藝中需要控制的基因毒性雜質(zhì)，并在充分理解產(chǎn)品質(zhì)量和工藝原理基礎(chǔ)上，采取科學(xué)的方法，對(duì)工藝中的基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行控制。

 

2.2 原料藥工藝中潛在基因毒性雜質(zhì)來(lái)源的評(píng)估

 

評(píng)估合成路線，側(cè)重于起始物質(zhì)、中間體、試劑、催化劑、溶劑、副反應(yīng)產(chǎn)物和降解產(chǎn)物等。對(duì)此，EMEA 建議“應(yīng)基于扎實(shí)的科學(xué)評(píng)價(jià)，全面考慮參與合成的化學(xué)反應(yīng)、原輔料中可能帶入新原料藥的雜質(zhì)和可能的降解產(chǎn)物，確定最有可能在新原料藥的合成、純化和貯存期間出現(xiàn)的實(shí)際和潛在雜質(zhì)。”

可能出現(xiàn)在API 中的潛在基因毒性雜質(zhì)一般可分為以下幾類：

①未反應(yīng)的具有警示結(jié)構(gòu)的物料或中間體(如含氮雜環(huán)API 中未反應(yīng)的硝基芳香化合物，由于不完全氫化作用或位置異構(gòu)體無(wú)法環(huán)化)。

②與包含警示結(jié)構(gòu)的物料、中間體或API 本身密切相關(guān)的物質(zhì)(如在工藝中用鹽酸處理后的含羥烷基的API 的氯烷基類似物)。

③通過(guò)溶劑和試劑兩者之間的相互合成作用，或與原輔料或中間體的合成作用形成(如由于在磺酰氯的反應(yīng)中，使用了異丙醇脫氧腺苷酸羥基中間體而形成了異丙醇甲苯磺酸鹽)。此外，在API 開發(fā)階段，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估還需考慮來(lái)源于生產(chǎn)期間或API 長(zhǎng)期貯存期間的降解物。

 

2.3 基因毒性雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)評(píng)估

 

EMEA 和FDA 指南草案都認(rèn)為使用結(jié)構(gòu)評(píng)估是一種有效的方法，可通過(guò)它進(jìn)行基因毒性潛在性的評(píng)估。常用的結(jié)構(gòu)評(píng)估商業(yè)軟件是DEREK和Mcase，這兩個(gè)系統(tǒng)費(fèi)用昂貴，小公司也可使用基于Ashby 和Tennant 警示的簡(jiǎn)單系統(tǒng)，詳見(jiàn)圖1。

 

 

2.4 基因毒性雜質(zhì)的分類

 

一旦完成了結(jié)構(gòu)評(píng)估，每個(gè)雜質(zhì)應(yīng)根據(jù)其基因毒性危害進(jìn)行分類。Lutz Mueller 等確定的5 類分類方案已被廣泛用于這個(gè)目的，見(jiàn)表2。

此外，SAR 評(píng)估程序也是有缺陷的，采用SAR評(píng)估程序并不能全面覆蓋所有基因毒性雜質(zhì)。因此需要根據(jù)安全性測(cè)試(Ames 測(cè)試)，單獨(dú)評(píng)估這些雜質(zhì)。如果雜質(zhì)沒(méi)有基因毒性標(biāo)記，但在工藝中作為親電試劑使用，仍需通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢確定其是否具有基因毒性，比如美國(guó)醫(yī)學(xué)圖書館提供的TOXNET 數(shù)據(jù)庫(kù)，可通過(guò)共同的門戶網(wǎng)站來(lái)訪問(wèn)一系列數(shù)據(jù)庫(kù)，如有害物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(HazardousSubstances Databank，HSDB)、化學(xué)致癌作用研究信息系統(tǒng)(Chemical Carcinogenesis ResearchInformation System，CCRIS)和集成風(fēng)險(xiǎn)信息系統(tǒng)(Integrated Risk Information System，IRIS)等，提供了許多常見(jiàn)化學(xué)品的安全性數(shù)據(jù)。另一個(gè)相關(guān)的系統(tǒng)是Berkeley 數(shù)據(jù)庫(kù)。實(shí)際上，采用足夠的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)化合物特定的成分進(jìn)行基因毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是經(jīng)常的做法，而不是簡(jiǎn)單使用TTC 限度進(jìn)行控制。

 

2.5 雜質(zhì)潛在遺留的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

 

一旦確定具有潛在基因毒性的雜質(zhì)，下一步就是考慮這些雜質(zhì)帶入原料藥中的可能性。由于基因毒性雜質(zhì)經(jīng)常是高活性的，能夠通過(guò)下游工藝去除，因此，可以結(jié)合雜質(zhì)的理化性質(zhì)，在下游工藝處理中采用適當(dāng)?shù)姆绞桨阉鼈內(nèi)コ?。例如，生產(chǎn)工藝中經(jīng)常遇到的酸性、堿性條件下可分解或去除雜質(zhì)，或者下游工藝中所用的其他試劑可與基因毒性雜質(zhì)反應(yīng)，使其不易反應(yīng)，從而“安全”。以下針對(duì)基因毒性雜質(zhì)的不同性質(zhì)，提供可行的工藝去除方法。

2.5.1 反應(yīng)活性 

許多基因毒性雜質(zhì)均具有高反應(yīng)活性，例如酰鹵化合物，因其極易反應(yīng)，使得在反應(yīng)結(jié)果中監(jiān)測(cè)它們幾乎無(wú)實(shí)際意義。而且，如果有任何殘留，可以通過(guò)某些方法有效地去除，如水淬滅或?qū)λ卯a(chǎn)物的簡(jiǎn)單水洗。

在工藝中，存在某些殘留物可能殘留在中間體中的可能性。對(duì)于這些化合物，在隨后的工藝步驟中具有高概率的反應(yīng)，例如，在合成早期考慮使用烷基鹵，另一個(gè)烷化劑應(yīng)在下游工藝中使用，則早期使用的烷基鹵殘留很可能消耗在后面階段，見(jiàn)圖2。該工藝中，第一階段用到的烯丙基溴殘留到第三階段，如果仍然存在，將反應(yīng)生成預(yù)期產(chǎn)物的烯丙基類似物。

 

 

基因毒性化合物的反應(yīng)活性可按表6 分類，該表只作為一個(gè)參考，具體情況應(yīng)根據(jù)實(shí)際工藝的化學(xué)反應(yīng)來(lái)評(píng)估。

 

 

2.5.2 溶解度-分離階段 

許多高度親電(往往是基因毒性)的試劑、中間體常常用于優(yōu)化產(chǎn)量和提高產(chǎn)品質(zhì)量的合成工藝中，并常常在溶液中完成反應(yīng)步驟。這便意味著基因毒性反應(yīng)物很可能高度溶于所選擇的溶劑。因此，當(dāng)工藝中將反應(yīng)產(chǎn)物分離為固體時(shí)，基因毒性反應(yīng)物被殘留在反應(yīng)母液中而除去，這可進(jìn)一步通過(guò)用一種基因毒性試劑易溶而反應(yīng)產(chǎn)物不溶的溶劑洗滌濾餅，而徹底去除基因毒性反應(yīng)物。這種情況下，基因毒性試劑的溶解度應(yīng)在置換溶劑中評(píng)估，以便確定合適的清除因子。

2.5.3 揮發(fā)性 

許多可能在典型的合成工藝中遇到的基因毒性物質(zhì)是揮發(fā)性的，包括低分子量烷基鹵、醛、氮/硫鹵乙基芥。常用蒸餾方法來(lái)降低或完全去除存在的反應(yīng)溶劑，因此也可有效地降低或消除殘留的基因毒性雜質(zhì)。這取決于基因毒性相對(duì)于溶劑沸點(diǎn)的揮發(fā)性。

2.5.4 電離度 

芳香胺是含能電離基團(tuán)的潛在基因毒性物質(zhì)的最好例子。大部分API 和中間體均具有潛在的電離。這種情況下，關(guān)注基因毒性物質(zhì)和基質(zhì)間可能存在的的電離度差異，便能通過(guò)改變水相的pH 值并萃取有機(jī)相，來(lái)降低基因毒性雜質(zhì)的水平。

硝基化合物還原至胺便是此類工藝的一個(gè)很好的例子。雖然它們具有一個(gè)共同的基因毒性代謝物中間體(一個(gè)正氮離子)，但是可能發(fā)現(xiàn)討論中的硝基化合物具有基因毒性，而其胺類似物則可能沒(méi)有。在這種情況下，需要去除硝基前體物，特別是如果相關(guān)的硝基化合物在下游工藝中不活潑，使得它可能以原形完成該工藝。

對(duì)于過(guò)量硝基化合物的去除，可以通過(guò)使用酸性水層的雙相系統(tǒng)，通過(guò)液液萃取來(lái)實(shí)現(xiàn)。任何非電離的硝基化合物將殘留在有機(jī)相中，而可電離的胺將殘留在水層中。棄去有機(jī)層，胺則在堿化后在新有機(jī)溶劑層中簡(jiǎn)單地反萃取。

在合成常見(jiàn)的止痛藥對(duì)乙酰氨基酚中，倒數(shù)第二階段涉及將4-硝基酚還原至相應(yīng)的胺，反應(yīng)混合物用甲苯萃取，堿化，再萃取胺。

2.5.5 色譜法 

從通過(guò)硅酸床的簡(jiǎn)單過(guò)濾，到制備型液相色譜法，色譜法為API 或中間體中基因毒性雜質(zhì)的去除提供了多種選擇。

制備型液相色譜法一般采用正相模式，即采用極性固定相(一般為硅酸)和非極性流動(dòng)性(有機(jī)溶劑系統(tǒng))。這與分析型液相色譜法不同，因?yàn)榇蟛糠址治錾V法都是在反相模式中進(jìn)行的。制備型液相色譜法采用正相模式是出于分離化合物的需要——使用易被除去的揮發(fā)性溶劑。也可以使用反相模式，但是除去基于水性溶劑系統(tǒng)的困難限制了適用范圍。

Bandichhor 等報(bào)告了利扎曲坦的純化，利扎曲坦是一種5 羥色胺-HT 受體激動(dòng)劑，其合成工藝中生成的基因毒性二聚合物雜質(zhì)不能通過(guò)普通的工藝去除，通過(guò)分步結(jié)晶和重結(jié)晶工序，不能達(dá)到0.01%的限度。因此，使用適當(dāng)?shù)膒H 值和離子強(qiáng)度改性來(lái)開發(fā)反相法，增加利扎曲坦和基因毒性二聚合物之間的選擇性?；蚨拘远酆衔飶?qiáng)烈地保留在柱子上，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的負(fù)載率達(dá)到最大生產(chǎn)率，而沒(méi)有任何可察覺(jué)的基因毒性二聚合物帶入到產(chǎn)品中。作者報(bào)告了基因毒性二聚合物水平從約40 000 ppm 減少到40~80 ppm( 產(chǎn)率>95%)。

2.5.6 重結(jié)晶 

重結(jié)晶是去除API 或中間體雜質(zhì)，包括基因毒性雜質(zhì)的最有效方法之一。采用該方法需要選擇一種適合的溶劑，使API 或中間體在高溫情況下高度溶解，而冷卻時(shí)幾乎不溶。高溫條件下通過(guò)過(guò)濾，去除不易溶于熱溶劑的雜質(zhì)，而較易溶于冷溶劑的雜質(zhì)保留在冷卻后的溶液中，通過(guò)過(guò)濾分離。

2.5.7 其他技術(shù) 

除以上技術(shù)外，還可通過(guò)其他手段去除基因毒性雜質(zhì)，如活性炭和樹脂?；钚蕴拷Y(jié)合重結(jié)晶工藝，可非常有效地去除有色雜質(zhì)。而樹脂去除法類似于萃取和分離技術(shù)，使基因毒性雜質(zhì)吸附在樹脂上，而所需產(chǎn)品保留在溶液中，從而通過(guò)過(guò)濾除去雜質(zhì)。

2.6 應(yīng)用加標(biāo)、清除法進(jìn)一步風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估除了

上述理論風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估外，還需要通過(guò)加標(biāo)清除法定量工藝對(duì)基因毒性雜質(zhì)的實(shí)際去除能力。加標(biāo)(spiking)指的是以固定的數(shù)量加入需要研究的基因毒性物質(zhì)；清除(purging)指的是下游工藝去除目標(biāo)雜質(zhì)的能力。

Liu 等摸索了加標(biāo)/清除研究的使用，報(bào)道了一種新型的抗肌瘤產(chǎn)品，鹽酸帕唑帕尼的5 個(gè)潛在基因毒性雜質(zhì)的分析控制策略見(jiàn)圖3(基因毒性雜質(zhì)用盒括標(biāo)識(shí))。

 

 

討論中的雜質(zhì)中的每一個(gè)以高水平(某些情況下高達(dá)5%)加標(biāo)至工藝中。然后使用雜質(zhì)預(yù)定命運(yùn)圖以證明下游產(chǎn)品中水平的連續(xù)降低。例如，第1階段產(chǎn)品含670 ppm 化合物ii，第2 階段產(chǎn)品23 ppm，而第3 階段產(chǎn)品中間級(jí)API 和最終API含不到1.7 ppm(化合物ii)。這使他們集中于起始物料或中間體的上游控制，并避免需要在制劑中進(jìn)行控制。這種方法的吸引力是它允許控制限度

設(shè)定在較高水平，并保證下游的清除將降低相關(guān)物質(zhì)的水平至可接受水平。它也允許控制策略基于不太復(fù)雜和靈敏的分析方法，這些方法更與常規(guī)質(zhì)量控制環(huán)境有關(guān)。

 

3.結(jié)論

 

藥品中基因毒性雜質(zhì)控制的主要挑戰(zhàn)是將雜質(zhì)的危害最小化和企業(yè)開發(fā)藥品成本之間的平衡。藥物研發(fā)過(guò)程中增加基因毒性雜質(zhì)的研究，包括限度的設(shè)定、分析方法研究、驗(yàn)證以及常規(guī)檢測(cè)都將嚴(yán)重拖長(zhǎng)藥品開發(fā)完成的時(shí)間線。基因毒性雜質(zhì)研究需要更多的時(shí)間和資源，延遲藥品上市時(shí)間，并增加藥品研發(fā)成本。因此，在藥物研發(fā)過(guò)程中應(yīng)用強(qiáng)大的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估來(lái)平衡患者用藥安全性及企業(yè)的生產(chǎn)控制成本，采用合適的手段控制產(chǎn)品中的基因毒性雜質(zhì)，是非常必要的。

EMEA 和FDA 草案指南以及ICH M7 草案都明確要求充分評(píng)估基因毒性雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，控制原料藥和藥品中基因毒性雜質(zhì)的殘留限度。為了滿足監(jiān)管要求，達(dá)到產(chǎn)品順利上市的目的，筆者認(rèn)為企業(yè)基于半定量評(píng)估，結(jié)合清除研究數(shù)據(jù)，建立科學(xué)的控制策略，使實(shí)際工藝中所有可能涉及的基因毒性雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)得到明確鑒別和控制，是達(dá)到監(jiān)管期望的有效途徑。